农杆菌草酸脱羧酶的原核表达与分泌特性验证

论文摘要

草酸脱羧酶（oxalate decarboxylases,OXDCs）降解草酸生成甲酸和二氧化碳。该酶属于cupin超家族bicupin亚族,在其氨基酸序列中,含有两个cupin结构域,每个cupin结构域由两个保守的基序:G（X）5HXH（X）11G和G（X）5P（X）4H（X）3N（这里X指代任意氨基酸）组成。目前发现的草酸脱羧酶主要存在于一些腐生真菌和细菌中。一些腐生型真菌在向体外分泌草酸的同时,也能合成草酸脱羧酶分泌到胞外。这种分泌型草酸脱羧酶的存在被认为可以降低草酸对自身的毒性,保持细胞内外稳定的pH环境,保持草酸合成和降解的平衡。细菌来源的草酸脱羧酶主要存在于细胞质中,其功能可能和O.formigenes中的草酰-辅酶A一样,与细菌细胞的能量代谢相关:草酸与甲酸的反向转运造成细胞外高内低的质子浓度差,这种质子梯度又同磷酸化偶联,驱动ATP的合成。但是最近的研究发现,B.subtilis在酸诱导（外加肌醇六磷酸）条件下,草酸脱羧酶（OxdC）是其细胞壁主要成分,在细胞质中没有发现有OxdC的存在;在B.subtilis芽孢发育过程中,草酸脱羧酶（OxdD）能分泌到胞外,是芽孢外壳内层的组成成分。然而在这两个草酸脱羧酶中都没有发现分泌信号的存在,其分泌机制还不清楚。在全基因组测序已经完成的农杆菌C58菌株（Agrobacterium tumefaciens strain C58）的基因组中,发现存在编码产物和已知的草酸脱羧酶在氨基酸序列上表现高度同源的基因序列（定名为AtuOXDC）。我们用PCR方法从A.tumefaciens strain C58基因组中克隆到的AtuOXDC基因,全长1248bp,编码产物为415aa,理论分子量为44.7 kDa。氨基酸序列含两个cupin domain,属cupin超家族bicupin亚族蛋白。其中N-端和C-端cupin domain分别由第120～第175位、第301～第367位氨基酸残基组成,每个cupin domain中两个motif之间相隔（inter-motif region,IMR）20个aa。氨基酸序列分析发现,AtuOXDC N-端含有一段疏水跨膜区（第7～第29位氨基酸）,推测可能是一段分泌信号,预测剪切位点在第27和第28位氨基酸残基之间。序列比对和系统树分析表明,AtuOXDC同来自Bradyrhizobium japonicum和Burkholderia的草酸脱羧酶氨基酸序列一致性较高,被聚为一类。同来自真菌的草酸脱羧酶亲缘关系也较近。在大肠杆菌中成功实现了AtuOXDC的过量表达,并通过亲和层析纯化了表达产物,发现AtuOXDC在体外能够降解草酸,确实具有草酸脱羧酶活性。通过在A.tumefaciens strain C58中分别表达全长和截去信号肽序列的AtuOXDC,证明农杆菌草酸脱羧酶N-段确实存在一段分泌信号,并将该酶定位于细胞周质中;通过定点突变试验,用-KK-取代AtuOXDC信号肽序列中Tat信号特征性基序-RR-后,免疫印迹试验表明AtuOXDC向胞外的转运通过Tat途径进行。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 一、草酸的来源及其危害
• 二、草酸在生物体内的降解
• 1 草酸的氧化降解
• 2 草酸的脱羧降解
• 三、草酸脱羧酶
• 1 草酸脱羧酶的来源及理化性质
• 1.1 来源
• 1.2 主要理化性质
• 1.3 OXDC酶活测定方法
• 2 草酸脱羧酶的一般结构特征——关于cupin超家族
• 2.1 cupin超家族的家族成员
• 2.2 OXDC的结构特征
• 3 真菌中的草酸脱羧酶
• 4 细菌中的草酸脱羧酶
• 5 草酸脱羧酶的应用
• 5.1 在以抗菌核病为目的和以降低内源草酸为目的的植物基因工程育种中的应用
• 5.2 在造纸工业和食品工业中的应用
• 5.3 在临床诊断中的应用
• 四、关于Tat途径
• 五、本项研究的目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 一、材料
• 1 质粒与菌株
• 2 试剂
• 3 引物合成和测序
• 二、实验方法
• 1 农杆菌草酸脱羧酶基因（AtuOXDC）的克隆及序列分析
• 1.1 农杆菌基因组DNA（total DNA）的提取
• 1.2 农杆菌草酸脱羧酶基因（AtuOXDC）的PCR克隆
• 1.3 农杆菌草酸脱羧酶基因（AtuOXDC）的序列分析
• 1.3.1 AtuOXDC PCR产物序列准确性确认
• 1.3.2 AtuOXDC N-端信号肽序列预测
• 1.3.3 多重序列比对和系统树分析
• 2 农杆菌草酸脱羧酶基因的原核表达、表达产物纯化及酶活性测定
• 2.1 截去信号肽序列的AtuTOXDC原核表达载体的构建
• 2.2 AtuTOXDC在E.coli中的诱导表达与纯化
• 2.3 AtuTOXDC原核表达产物的酶活性分析
• 2.4 AtuOXDC抗血清的制备
• 3.农杆菌草酸脱羧酶的分泌特性验证
• 3.1 含全长和截去信号肽序列的pTrFOXDC和pTrTOXDC农杆菌表达载体的构建
• 3.1.1 pTrFOXDC载体构建
• 3.1.2 pTrTOXDC载体构建
• 3.2 全长和截去信号肽序列的AtuOXDC在E.coli中的表达
• 3.2.1 AtuFOXDC和AtuTOXDC在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达及样品制备
• 3.2.2 SDS-10%PAGE样品制备
• 3.2.3 SDS-10%PAGE和western-blots检测
• 3.3 含-RR-定点突变的农杆菌表达载体pTrMOXDC的构建
• 3.3.1 AtuOXDC N-端信号肽-RR-基序的定点突变
• 3.3.2 pTrMOXDC载体的构建
• 3.4 AtuOXDC分泌特性验证
• 3.4.1 pTrFOXDC、pTrTOXDC和pTrMOXDC质粒转化A.tumefaciens C58细胞
• 3.4.2 AtuFOXDC、AtuTOXDC和AtuMOXDC基因在A.tumefaciens C58中的诱导表达
• 3.4.3 农杆菌草酸脱羧酶的亚细胞定位
• 第三部分 结果
• 一、农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的克隆及序列分析
• 1.农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的克隆
• 2.AtuOXDC N-端信号肽序列预测
• 3.多序列比对和系统树分析
• 4.农杆菌草酸脱羧酶序列分析
• 二、农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的原核表达、表达产物纯化及酶活性测定
• 1.pET-AtuTOXDC原核表达载体的构建
• 2.AtuOXDC基因的原核表达
• 3.AtuOXDC基因原核表达产物NiNTA柱亲和层析纯化
• 4.AtuOXDC原核表达产物的酶活性测定
• 三、农杆菌草酸脱羧酶的分泌特性验证
• 1.pTrFOXDC和pTrTOXDC载体的构建
• 2 含-RR-定点突变的农杆菌表达载体pTrMOXDC的构建
• 2.1 AtuOXDC N-端-RR-基序的定点突变
• 2.2 pTrMOXDC载体的构建
• 3.AtuOXDC在大肠杆菌中的表达产物存在剪切信号
• 4.农杆菌草酸脱羧酶分布于细胞周质中
• 5.农杆菌草酸脱羧酶通过Tat途径分泌
• 第四部分 讨论
• 一、来自A.tumefaciens C58的草酸脱羧酶的克隆
• 二、农杆菌草酸脱羧酶的结构特征
• 三、农杆菌草酸脱羧酶的原核表达和活性检测
• 四、农杆菌草酸脱羧酶通过Tat途径转运
• 小结
• 参考文献
• 在学期间发表论文
• 在学期间获得成果及参与编写专著
• 在学期间主持或参与的课题
• 致谢