外源性p16基因对人肝癌细胞生物学行为的影响及其机制

论文摘要

目的:构建人p16cDNA重组真核表达载体。探讨转入外源性p16cDNA对人原发性肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响及其抑制细胞生长的机制。 方法:从pBS-p16克隆载体中,将人p16cDNA亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,构建含人p16cDNA的重组质粒pcDNA3.1+-p16,并经双酶切和测序鉴定。将该重组质粒转染人SMMC-7721细胞,经G418抗性筛选和扩增得到稳定表达p16的亚细胞株及稳定表达pcDNA3.1+的对照亚细胞株,并经RT-PCR及免疫细胞化学鉴定。通过细胞计数法,流式细胞术,免疫细胞化学及Western blot等实验方法,对外源性p16基因导入人肝癌细胞后的细胞生物学行为及细胞周期调控因子CyclinD1及pRb进行观察。 结果:成功地构建含人p16cDNA的重组表达质粒pcDNA3.1+-p16,测序证明p16cDNA编码序列与Genbank中报道的序列一致。转染外源性p16基因的SMMC-7721细胞有外源性p16基因的整合及表达,细胞生长速度明显减慢,细胞群体倍增时间明显延长（37.8h vs 24.3h）,G1期细胞明显多于转基因前（57.9% vs 41.5%）（P<0.05）;免疫细胞化学检测显示外源性p16表达可下调cylinD1的表达（P<0.05）,Western blot分析提示转染外源性p16基因后细胞中磷酸化pRb水平明显降低。 结论: 1、成功构建含人p16cDNA的重组表达质粒pcDNA3.1+-p16; 2、外源性p16基因导入人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中可稳定表达并使细胞周期停滞在G1期,抑制细胞生长; 3、外源性p16基因抑制细胞生长的机制可能与下调cyclinD1表达,抑制pRb磷酸化相关。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、论文正文
• （一） 前言
• （二） 实验材料
• （三） 实验方法
• （四） 实验结果
• （五） 讨论
• （六） 结论
• 四、参考文献
• 五、附图
• 六、文献综述
• 七、主要缩略语英文索引
• 八、致谢