论文摘要
喹诺酮类药物是发展迅速且应用广泛的广谱抗菌药物。此类药物的组织药物浓度高,且分布广泛,故成为水产养殖中重要的抗感染药物之一。长期以来,在水产养殖业中使用的喹诺酮类药物品种混乱,且出现反复、超量使用的情况。而该类药物的残留可对人、畜、鱼产生副作用,具有致畸、致癌作用。因此,制定一套快速、有效的水产品中喹诺酮药物残留检测方法,研究该类药物中普遍使用的药物——恩诺沙星,在鲫鱼不同健康状况下的体内药代动力学,同时研究恩诺沙星对鲫鱼肝脏脂肪酸组成的影响,对监控水产养殖业中该类药物的安全使用意义重大。本研究分为三个部分,第一部分为利用UPLC-MS/MS技术建立一种同时检测水产品中20种喹诺酮类药物残留的分析方法；第二部分研究健康和非健康鲫鱼口灌恩诺沙星后的药代动力学变化,分析不同健康状况下该药物在血液和肝脏中的吸收、分布和代谢的差异。第三部分为以口灌恩诺沙星的鲫鱼肝脏作为研究对象,从脂肪酸组成的变化角度来研究恩诺沙星对鲫鱼肝脏可能产生的不良影响。本研究的第一部分利用UPLC-MS/MS技术建立一种同时检测水产品中喹诺酮类药物残留的分析方法。对样品前处理（提取液、提取方式和净化方法）及分离条件进行优化,样品经柠檬酸磷酸盐缓冲液（Mcllvaine）超声提取,采用固相萃取（SPE）方法净化提取液,并对目标物质进行富集,建立了同时检测水产品中20种喹诺酮类药物的UPLC-MS/MS分析方法。该方法对色谱柱、流动相体系、色谱和质谱相关参数进行了选择优化。结果表明：依诺沙星、奥索利酸、培氟沙星、帕珠沙星、氟罗沙星含量在3～300μg/kg范围,萘啶酸、氟甲喹含量在0.5～50μg/kg范围,其余13种喹诺酮类化合物含量在1～100μg/kg范围内均具有良好的线性关系,相关系数0.9981～0.9999,定量限（LOQ）0.34～8.13μg/kg。药物含量在5～150μg/kg范围,除氟甲喹、萘啶酸外,其它喹诺酮的回收率均在63.6%-92.8%之间,相对标准偏差1.51%～11.32%。该方法灵敏度高,定性定量准确,分析速度快,可满足水产品中喹诺酮类药物多残留检测的要求。第二部分对口灌恩诺沙星后的健康和非健康鲫鱼的比较药代动力学进行研究,全面比较了不同健康状况下恩诺沙星在血液和肝脏中的吸收、分布和代谢的差异。结果表明：本研究条件下,口灌给药后恩诺沙星在健康和非健康鲫鱼血液中均符合一级吸收二室模型。健康组分布半衰期（t1/2ka=0.42 h）高于非健康组（t1/2ka=1.11 h）,而消除半衰期（t1/2β=7.18 h）低于非健康组（t1/2β=18.93h）,曲线下面积（AUC=22.85μg/mL·h）高于非健康组（AUC=18.21μg/mL·h）,平均残留时间（MRT=10.53 h）低于非健康组（MRT=20.89 h）。口灌给药后恩诺沙星在两组鲫鱼肝脏中也均符合一级吸收二室模型,其中健康组和非健康组的吸收半衰期（tl/2ka）分别为0.47 h和1.27 h,消除半衰期（t1/2β）分别为23.71 h和25.66 h,总曲线下面积（AUC）分别为85.77μg/mL·h和26.13μg/mL·h；平均残留时间（MRT）则分别为10.53 h和20.88 h。通过药代动力学研究,与健康组鲫鱼比较,非健康组鲫鱼的吸收、分布和消除都因为遭受病菌侵害而受到影响,达到峰值后1-1.5 h恩诺沙星在非健康鲫鱼的血液和肝脏浓度的降幅分别为67.16%和52.31%,表现出“首过效应”。比照恩诺沙星的最高残留限量规定,对微发病或已发病鱼体使用恩诺沙星进行治疗则需要10d以上的休药期。第三部分以口灌恩诺沙星的鲫鱼肝脏作为研究对象,从脂肪酸组成的变化角度来研究恩诺沙星对鲫鱼肝脏可能存在的不良影响。本研究提取口灌恩诺沙星后的鲫鱼肝脏的总脂质,采用薄层色谱对总脂质进行制备分离,利用气相色谱分析各组分的脂肪酸组成的变化。结果表明：口灌药物后,肝脏脂肪酸中的饱和脂肪酸含量水平增加明显,多不饱和脂肪酸含量水平下降,根据临床研究的饱和脂肪酸含量上升可导致胰岛素敏感性降低的报道,预示恩诺沙星有抑制胰岛素敏感性的可能性。总脂质脂肪酸组成中的C20：4-n6含量呈现上升趋势,根据相关研究报道C20：4-n6的增加可促使肝星状细胞的活化,预示恩诺沙星可能造成鱼体肝脏星状化。同时单不饱和脂肪酸也呈缓慢上升趋势,根据临床报道过氧化酶的缺失可导致油脂形成脂肪滴的研究,预示恩诺沙星可导致肝脏脂肪滴的形成。由此可推测对鲫鱼口灌恩诺沙星后,恩诺沙星会对鱼体肝脏及其健康造成不良影响,若养殖业长期交叉使用恩诺沙星等抗生素易导致鱼体肝脏受损,并可能造成鱼体肝脏坏死最终导致死亡。
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