夹心ELISA方法检测熟肉中猪肉成分的研究

论文摘要

消费者由于经济损失、食物过敏、宗教信仰和食品安全等因素,对肉类掺假越来越关注。肉类掺假在生肉和熟肉制品中都有很高的比例,在熟肉中的掺假比例高于在生肉中的掺假比例。生肉的鉴别方法已成熟,而熟肉制品的鉴别由于蛋白质在加热期间会产生变性、溶解度降低、丧失抗原性,难以鉴别。猪骨骼肌肌钙蛋白I是猪肉特有的蛋白质,可作为耐热种类标志蛋白鉴别熟肉制品的肉种类来源。本试验采用原核表达系统获得重组猪快骨骼肌肌钙蛋白I （TnI-fast）,制备单克隆抗体和多克隆抗体,初步建立鉴别熟肉中猪肉成分的夹心ELISA方法,为鉴别熟肉制品中的种类掺假提供技术手段。主要研究结果如下：1.猪骨骼肌TnI-fast基因的克隆与表达利用本实验制备的质粒pMD18-T-TnI-fast,连接到表达载体pET-32a和pGEX-KG,构建了原核表达质粒pKG-TnI-fast和pET-32a-TnI-fast,并在E.coliBL21（DE3）中表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测表明诱导表达成功,经透析纯化后获得目的重组蛋白GST-Tnl-fast和His-Tnl-fast, Western blot结果表明重组蛋白具有良好的免疫反应性。2.抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I多克隆抗体的制备与纯化将重组蛋白GST-Tnl-fast和His-Tnl-fast作为免疫原,免疫兔子,制备了兔抗GST-TnI-fast和His-Tnl-fast的血清,分别采用饱和硫酸铵粗提和Sephadex G-200过柱纯化血清,获得抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I多克隆抗体。3.抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备与纯化将重组蛋白GST-Tnl-fast和His-TnI-fast作为免疫原,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经过细胞融合和克隆,用纯化好的His-Tnl-fast和GST-Tnl-fast作为筛选抗原筛选,获得了四株能稳定分泌抗TnI-fast蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D7、2B2、3C3、2F4。腹水ELISA效价均在1：0.8×106以上,经过辛酸硫酸铵法获得了纯度较高的单抗。4.检测猪肉的夹心ELISA方法的建立以纯化的抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体作为捕获抗体,抗猪快骨骼肌肌钙蛋白I多克隆抗体作为检测抗体,建立检测熟肉中猪肉成分的的夹心ELISA。单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度均为8μg/mL,特异性好,灵敏度高,最低能检测到0.50%的掺杂,重复性好。5.对市售熟肉制品的测定市场购买熟肉制品,用夹心ELISA方法测定其中是否含猪肉成分。用组织基因组DNA提取试剂盒提取夹心ELISA实验中检测含猪肉的掺假样品的基因组。按照GB T21101-2007和SN T1119-2002的标准进行PCR-RFLP,二者阳性符合率为100%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 肉类掺假问题的国内外现状
• 1.1.2 肉种类鉴别方法研究进展
• 1.1.3 猪骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ研究进展
• 1.2 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 载体及菌株
• 2.1.2 酶及主要试剂
• 2.1.3 主要仪器及器材
• 2.1.4 实验动物及细胞
• 2.1.5 肉样
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪骨骼肌TnⅠ-fast基因的克隆与表达
• 2.2.2 兔抗猪快骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备
• 2.2.3 抗猪快骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备
• 2.2.4 检测熟肉制品中猪肉的夹心ELISA的建立
• 2.2.5 熟肉制品的符合实验
• 3 结果与分析
• 3.1 猪骨骼肌TnⅠ-fast基因的克隆与表达
• 3.1.1 TnⅠ-fast基因克隆
• 3.1.2 重组TnⅠ-fast蛋白的诱导表达
• 3.1.3 表达产物的Western blot鉴定
• 3.2 兔抗猪快骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ多克隆抗体的制备
• 3.2.1 免疫血清效价测定
• 3.2.2 兔抗TnⅠ-fast IgG的纯化
• 3.3 抗猪快骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备
• 3.3.1 抗原最佳包被浓度的确定
• 3.3.2 免疫小鼠血清效价的测定
• 3.3.3 阳性克隆的筛选与杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.4 杂交瘤细胞染色体分析
• 3.3.5 腹水的制备及抗体效价测定
• 3.3.6 单抗5D7的纯化
• 3.3.7 单抗5D7亲和力测定
• 3.3.8 单抗5D7的特异性鉴定
• 3.4 检测熟肉制品中猪肉的夹心ELISA的建立
• 3.4.1 MAb和PAb最佳工作浓度的确定
• 3.4.2 特异性实验
• 3.4.3 灵敏性实验
• 3.4.4 重复性实验
• 3.4.5 对市售熟肉制品的测定
• 3.5 熟肉制品的符合实验
• 3.5.1 基因组DNA的提取
• 3.5.2 基因组PCR
• 3.5.3 酶切PCR产物
• 3.5.4 结果判定
• 3.5.5 符合率
• 4 讨论
• 4.1 目的蛋白的选择
• 4.2 原核表达载体的选择
• 4.3 抗体的制备
• 4.4 夹心ELISA方法的建立
• 4.5 对市售熟肉制品的检测
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢