论文摘要
近年来,随着许多抗性基因（R基因）的克隆,对植物与病原物相互作用分子机理的研究取得了许多突破性进展,推动了对植物抗性的研究。然而与R基因控制的植物抗性研究相比,对植物非寄主抗性分子基础的认识还比较滞后。非寄主抗性是植物对大多数病原物产生抗性,对少数病原物感病,是最主要的抗病类型,它不是由植物单个专化性抗病基因控制的,不易随着病原微生物的变异而丧失,具有稳定持久抗性的特点,因此在农业上有广阔的应用前景。大麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.Hordei,Bgh）对拟南芥本身是不致病的,通过筛选Bgh对拟南芥有高致病力的拟南芥突变体克隆了PEN基因,目前有三个基因AtPEN1（=AtSYP121）,AtPEN2和AtPEN3参与控制形成抗性物质的生物合成和分泌过程,AtPEN1编码一个可溶N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的因子适配器蛋白质受体（SNARE）结构域和质膜定位的Syntaxin,参与调控囊泡的分泌途径,说明存在与囊泡相关的抗性机制产生对粉状病原物的非寄主抗性。拟南芥AtPEN1和大麦HvROR2对植物非寄主抗性的研究起着重要作用,我们通过研究也发现拟南芥AtPEN1对小麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.trtici,Bgt）的非寄主抗性也同样起着非常重要作用,水稻OsPEN1与拟南芥AtPEN1和大麦HvROR2的同源性非常高,它们都含有非常保守的Qa-SNARE结构域,南京农业大学报道水稻OsNPSN11编码的Qb-SNARE参与稻瘟病抗性,并将该基因申请了专利。Qa-SNARE与Qb-SNARE同属于SNARE蛋白家族,于是我们推测OsPEN1对水稻抗性起着重要作用。本研究通过在NCBI网站上BLAST比对,在水稻日本晴中获得了与拟南芥AtPEN1和大麦HvROR2的同源序列OsPEN1,通过PCR法成功克隆了OsPEN1基因,对OsPEN1基因构建过量表达和RNA干涉载体并通过农杆菌介导法转化水稻,通过PCR检测转基因阳性植株,然后通过RT-PCR及Northern杂交分析转基因植株,对转基因植株接种水稻真菌稻瘟病菌和纹枯病菌和水稻细菌白叶枯病菌进行抗病性鉴定,最后对OsPEN1蛋白进行生物信息学分析,其主要的研究结果如下:1.OsPEN1基因的克隆。由于OsPEN1基因无内含子,以水稻日本晴植株总DNA为模板,设计OsPEN1基因的特异引物,PCR法克隆了OsPEN1基因,琼脂糖凝胶电泳分离、回收,并连接进pMD18-T载体中,酶切、测序鉴定重组阳性质粒。2.植物表达载体的构建。将重组质粒和植物的表达载体分别用相应的限制酶酶切后,将酶切的OsPEN1片段亚克隆到表达载体中构建重组表达载体,用酶切、PCR鉴定和测序的方法鉴定出重组阳性质粒pCAMBIA-OsPEN1和pUC-OsPEN1,然后通过农杆菌介导法转化水稻日本晴。3.T0转基因植株的PCR检测。获得卡那霉素抗性植株22株RNA干涉和22株过量表达转基因水稻植株,经PCR检测,从22株过量表达水稻植株中获得了20株转基因阳性苗,从22株RNA干涉水稻植株中获得了17株转基因阳性苗。4.OsPEN1基因的RT-PCR分析。取转基因植株叶片提取RNA,对OsPEN1进行RT-PCR,发现OsPEN1的过表达水稻植株的表达水平明显高于对照植株,RNA干涉水稻植株低于对照植株,表明在转录水平上,OsPEN1在转基因水稻植株中得到了正常表达。分别取接种纹枯病菌前和接种纹枯病菌后的转基因植株叶片,提取RNA,对PR-1,NPR-1基因进行RT-PCR,结果发现转基因植株接种纹枯病菌后其表达水平比接种前高,说明OsPEN1的表达受到纹枯病菌的诱导。5.转基因植株的Northern blotting分析。对转基因阳性植株进行Northem blotting分析,结果发现,与对照相比,12株过量表达转基因阳性苗比对照表达量高,10株RNA干涉水稻转基因阳性苗比对照表达量低,表明OsPEN1在转基因植株中得到了正常的表达。6.转基因植株的抗性鉴定。分别对转基因RNA干涉和过量表达水稻植株接种水稻稻瘟病菌,水稻白叶枯病菌和水稻纹枯病菌进行抗病性鉴定,结果发现,大多数转基因过量表达水稻植株比转基因RNA干涉水稻植株表现为抗病,非转基因对照植株感病状态介于两者之间,OsPEN1基因表现出对多种病菌抗病,可能与植物的非寄主抗性有关。7.生物信息学分析。OsPEN1蛋白含一个跨膜结构域,跨膜区域为284-305区域。OsPEN1蛋白的212-274位点为Qa-SNARE核心结构域,核心结构域比较保守,OsPEN1蛋白的Qa-SNARE结构域与各家族成员具有较高的同源性,Qa-SNARE通过参与抗病信号途径而增强植物的抗病性。