OIE标准布鲁氏菌ELISA和PCR检测方法在奶牛奶样中的应用研究

论文摘要

?布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患病,在世界范围内导致巨大的经济损失,布鲁氏菌是该病病原。随着个体养牛户的增加,奶牛布病的疫情呈逐年上升趋势,同时由于布病也可传染给人,从而给人类公共卫生安全造成了严重隐患,因此采取一切措施防治牛布病刻不容缓。为探讨以牛奶为材料检测奶牛布鲁氏菌感染的可行性,本研究在不同牛场收集检测样品包括奶液和血清。试验中首先选用奶液间接ELISA（M-I-ELISA）进行筛选,随后结合间接ELISA做进一步的实验室诊断,最终采用竞争ELISA对被检样品进行确诊。结果显示,Milk-I-ELISA与I-ELISA、C-ELISA具有较高的一致性。Milk-I-ELISA不仅能够检测个体奶样还可以检测混合奶样。本试验中,Milk-I-ELISA检测混合奶样的灵敏度高,在临床检测过程中与血清检测结果保持一致,适合牛群布病感染情况的监测,能够第一时间做出早期诊断。本研究还建立了可鉴定布鲁氏菌属的单重PCR以及鉴定布鲁氏菌种的多重PCR。单重PCR以BCSP31为布鲁氏菌属特异性靶基因为基础,多重PCR的建立方法是以扩增布鲁氏菌长度多态性基因IS711为基础。结果显示,单重PCR方法的特异性强只特异性的扩增布鲁氏菌DNA,对照菌株大肠杆菌、牛败血性波氏杆菌、根瘤农杆菌和苍白杆菌等的扩增结果均为阴性;灵敏度高,奶液中细菌检测灵敏度为1.08×104CFU/mL;用建立的多重PCR对7株不同种来源的布鲁氏菌体和基因组进行鉴定,表明该方法可以区分布鲁氏菌的种和部分生物型。本研究中建立的PCR方法能够鉴定所有致病性布鲁氏菌并对疫苗株和野生毒株加以区分,适用于实验室布鲁氏菌的快速鉴定。综上所述,以奶液为样品,ELISA和PCR方法分别从抗体和病原两个方面对布鲁氏菌病进行检测,具备区分疫苗免疫和野生型布鲁氏菌感染的能力,可满足目前临床上布鲁氏菌病诊断的需要,对我国奶牛布鲁氏菌病的防治、监测和净化具有重要意义,同时也提供了技术支持和物质基础。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 布鲁氏菌病
• 1.1.1 布鲁氏菌病的危害
• 1.1.2 流行病学
• 1.2 布鲁氏菌的简介
• 1.2.1 布鲁氏菌的历史
• 1.2.2 布鲁氏菌种和生物型的分类
• 1.2.3 布鲁氏菌病原学特征
• 1.3 布鲁氏菌病诊断
• 1.3.1 病原鉴定
• 1.3.2 血清学检测方法
• 1.4 布鲁氏菌病在中国的流行及防治措施
• 1.4.1 中国动物布鲁氏菌病流行概况
• 1.4.2 中国布鲁氏菌病诊断主要难点
• 1.4.3 中国布鲁氏菌病防治措施
• 1.5 布鲁氏菌奶样检测的应用及意义
• 1.6 目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株，奶液和血清
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 OIE 标准布鲁氏菌ELISA 检测方法在奶牛奶样中的应用研究
• 2.2.2 OIE 标准布鲁氏菌PCR 检测方法在奶牛奶样中的应用研究
• 3. 结果与分析
• 3.1 OIE 标准布鲁氏菌ELISA 检测方法在奶牛奶样中的应用研究
• 3.1.1 Milk-I-ELISA 的敏感性试验
• 3.1.2 三种试剂盒检测结果
• 3.1.3 Milk–I-ELISA 与I-ELISA 和C-ELISA 对布病感染牛场检测结果的比较
• 3.1.4 M-I-ELISA 检测方法的临床应用
• 3.2 OIE 标准布鲁氏菌PCR 检测方法在奶牛奶样中的应用研究
• 3.2.1 单重PCR 的优化结果
• 3.2.2 单重 PCR 的扩增结果
• 3.2.3 单重 PCR 的特异性试验
• 3.2.4 单重 PCR 的敏感性试验
• 3.2.5 单重 PCR 与血清学检测结果的比较
• 3.2.6 单重 PCR 的重复性结果
• 3.2.7 多重 PCR 条件优化结果
• 3.2.8 多重 PCR 扩增结果
• 3.2.9 引物的交叉特异性分析
• 3.2.10 临床样品的多重 PCR 检测
• 3.2.11 多重 PCR 重复性结果
• 4. 讨论
• 4.1 M-I-ELISA 方法的初步应用
• 4.2 检测混合奶样中布鲁氏菌病抗体的探讨
• 4.3 单重 PCR 检测方法的应用
• 4.4 多重 PCR 检测方法的应用
• 4.5 奶液中病原菌核酸的提取
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文