论文摘要
自20世纪90年代以来,抗逆转录病毒治疗（ART）以其良好的病毒抑制效果,作为治疗艾滋病的最主要手段在全世界范围内被广泛应用。但ART并不能把病人体内的HIV彻底清除,在药物选择压力下耐药性病毒株迅速产生,这被认为是影响抗病毒治疗效果的主要原因。HIV基因型耐药性检测方法是检测病毒耐药情况,进而评估临床治疗效果及治疗失败后更换治疗方案的重要技术手段。在艾滋病的传播过程中,HIV-1 M组不同亚型的基因组存在着10%-30%的差异,在pol基因的差异为10%-15%,这会导致HIV-1不同亚型的耐药进化模式存在差别,在特定药物压力下可能具备各自的耐药形式和频率。在全球范围内HIV-1存在特异性亚型分布,B亚型广泛分布于发达国家,而非B亚型主要分布于发展中国家,非B亚型HIV-1虽然约占到世界上所有HIV-1感染的90%,但是有关报道和研究相对较少。我国主要流行的为中国B’、CRF01AE和CRFO7BC亚型,但是迄今为止有关我国非B亚型的治疗失败病人的耐药特征的报道很少。对我国流行的主要HIV-1亚型进行基因型耐药研究,总结抗病毒治疗失败病人的耐药特征进而应用于临床治疗中显得非常必要,特别是了解非B与B亚型HIV-1在耐药突变特征上的差别在为病人设计ART治疗方案或制定国家基本治疗策略时具有重要的参考价值。本研究第一部分采用基因型耐药性检测方法,对采集自九个省/自治区（河南、安徽、广西、云南、新疆、湖南、浙江、山东、广东）的中国B’（2I1例）、CRF07BC亚型（77例）和CRF01AE（58例）HIV-1治疗患者进行了横断面研究。在此项研究中发现,在346例中国ARV治疗病人中,M184VI（137,39.60%）, T215YF（66, 19.08%）, M41L（38,10.98%）是中国出现最多的三种ARV治疗相关的NRTIs耐药相关突变,而K103N（101,29.19%）, Y181 C（82,23.70%）和G190SA（60,17.34%）则是中国出现最多的三种ARV治疗相关的NNRTIs耐药相关突变。我们发现在中国流行的三种亚型（B’,CRF07BC和CRF01AE）的样本中在氨基酸水平分析的耐药突变频率存在差异,在治疗时间相近的情况下B’亚型毒株相比CRF07BC亚型HIV-1累积了更高比例的耐药突变。在接受含3TC的晚期一线治疗方案治疗的病人中,CRF07BC亚型感染者发生NRTI和NNRTI耐药相关的耐药株的突变比例（55.7% vs.34.2%；67.8% vs.50.0%）和发生耐药突变的平均数目均显著性低于B亚型（1.270 vs.0.447；1.330 vs.0.868）；另外,至少发生一种主要耐药突变的平均数目也显示CRF07BC亚型显著性低于B’亚型（2.600 vs.1.355）。在确定耐药位点发生频率的亚型间差异未受到亚型间ARV治疗时间不同的影响后,又发现在接受晚期一线治疗方案治疗的患者中的特定氨基酸位点的NRTIs和NNRTIs相关耐药突变在亚型间的发生频率存在差异。胸苷类似物相关突变（TAMs） M41L, D67N, K70R, T215YF,和NNRTI（?）目关耐药突变Y181C在亚型间存在统计学差异。M41L, T215YF和Y181C在B’亚型中的发生率显著性高于CRF07BC亚型（分别为9.52% vs.1.32%；17.86% vs.1.32%；26.19% vs.13.16%）；D67N, K70ER在CRF01 AE亚型分离株中的发生率显著性高于CRF07BC亚型（14.29% vs.1.32%；10.20% vs.1.32%）。总之,通过分析B’,CRF07BC和CRF01AE亚型HIV-1患者接受ARV抗病毒治疗后样本pol区基因后发现了NRTIs和NNRTIs耐药相关突变的发生存在亚型间差异。结果显示在排除治疗时间和治疗方案的影响后,在药物压力下CRF07BC亚型感染者中的耐药突变率明显低于B’亚型,B’亚型相（?）（?）CRF07 BC亚型可能更容易产生耐药突变。在中国流行的三种亚型中发生的耐药特征差异可能具有亚型特异性,进而可能会影响特定抗病毒药物的效用及ART的有效性和持久性。为了观察我国长期接受抗病毒治疗的艾滋病病人的治疗效果、耐药发生和发展的规律,我室在河南和安徽两省建立了前瞻性研究队列,目前两个队列已随访了6年。在本研究的第二部分通过单基因组测序的方法,对队列中部分病人体内的HIV-1耐药准种的耐药突变形式、变化规律进行了探讨。研究对象的选择原则为：①初始治疗方案一致（早期一线治疗方案）；②队列样本大部分时间点的病毒载量≥1000拷贝/毫升；③常规耐药基因型检测的耐药位点呈现随治疗时间的累加规律。HIV-1耐药准种对耐药检测的影响研究以安徽接受抗病毒治疗的4个艾滋病病人为研究对象,自2004年至2010年以六个月为间隔随访持续六年以上,初始治疗方案均为DDI+D4T+NVP,有两例病人持续使用此早期一线药物方案治疗,另外两例均在2005年更换晚期一线药物治疗方案AZT+3TC+EFV。4例患者的单基因组扩增结果显示,病毒载量和CD4数目与患者体内耐药准种的突变形式存在一定关系,带有耐药位点的HIV-1准种比例随着治疗时间的延长在不断增加；针对NRTIs耐药的突变位点,单一位点突变在起始时占主导地位,随后单一位点突变逐渐减少,演化的最终趋势是多位点突变型代替单位点突变型,并且单一位点突变对耐药程度的影响远小于多位点突变。本研究发现与NRTIs耐药突变不同,这4例患者针对NNRTIs的耐药突变无论单一突变还是多位点突变,一旦产生即可长期存在,这些位点的出现多可直接导致高度耐药。HIV-1耐药突变形式稳定性的研究发现,单一位点突变K103N比较稳定,突变型K103N/Y181C, K101E/Y181C/G190A, K103N/V179F/Y181C, K101E/V108I/Y181C/G190A为最稳定的突变组合形式,即均能在患者体内稳定保持24个月以上,提示携带这些突变的病毒准种的适应性较好。患者在治疗不连续且换药的情况,在初次检出时均只出现单一位点突变,这些位点几乎都属于非典型性的耐药突变,一般不能产生中到高度耐药,在后期的随访中逐渐被多位点的突变形式所代替,而且耐药突变位点比例在增加,并且ANHDR007和ANHDR013患者体内新增的耐药位点多为换药后针对新药的相关耐药突变位点,且呈现明显的时间相关性。在患者停药的区间段,伴有患者体内野生株占优势的情况；连续使用早期一线药用药治疗情况的患者出现的耐药形式较少而且较为稳定。总之,在药物压力下HIV-1耐药准种的发生和进化与病毒适应性的关系非常密切。另外,SGA相比In House耐药基因型检测方法在检测所有耐药突变位点的检测能力比较后发现,SGA比常规基因型耐药检测方法提前检测到的耐药突变位点共计10个,其中包括5个NRTI耐药相关突变T215Y, M41L, M184V, L74I, L210W;5个针对NNRTIs的耐药突变K103N, G190A, K101E, Y181C, V108I,提前时间为6-53个月不等。带有这些位点的HIV-1准种所占的比例平均为41.1%,除了K103N和Y181C比例稍高外,带有其它耐药突变位点的HIV-1准种所占的比例都低于37.5%。其余14个耐药位点显示为SGA与常规基因型耐药检测方法在同一时间点检出,带有这些位点的HIV-1准种所占的比例平均为74.57%。这说明常规基因型耐药检测在指导临床和更换药物的时候会出现一定的滞后,SGA对耐药准种的检测特别是具有重要耐药意义的低含量突变位点比普通方法具有优势,而在耐药准种比例较高时,SGA相比常规基因型耐药检测优势并不明显。总之,SGA方法能检测到比例较低的劣势耐药突变株,可以提前预测病人的耐药发生,并且为系统研究病人体内病毒准种在持续药物压力下的适应性进化规律提供了方法。
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