论文摘要
本实验采用Ficoll密度梯度离心法分离出日本七鳃鳗单个核细胞层,并得到分离单个核细胞层的最佳分离液比重为1.092。利用流式细胞仪对分离到的单个核细胞层细胞进行分选,根据细胞的前向光及侧向光散射特征成功分选出类淋巴细胞,分选效率为95.68%,每毫升外周血可分离纯化得到类淋巴细胞2.4×106个。通过透射电镜观察七鳃鳗类淋巴细胞,细胞为圆形或椭圆形,细胞表面有突起、无微绒毛,胞质内含有板状嵴线粒体、粗面内质网、游离核糖体和液泡等。通过淋巴细胞转化实验分析了日本七鳃鳗类淋巴细胞的异质性。首先,日本七鳃鳗类淋巴细胞的ANAE染色结果没有出现类似高等脊椎动物T细胞所具有的阳性棕红色反应颗粒。之后,用PHA与SPA做刺激剂,分别激活T、B淋巴细胞的转化而分裂,检测淋巴细胞的异质性,也未发现T淋巴细胞、B淋巴细胞的分化。以上实验仅从细胞形态和组织化学研究等侧面分析了日本七鳃鳗类淋巴细胞的异质性,表明在日本七鳃鳗的类淋巴细胞中可能尚未分化出T、B两大类群。本文将限制片断差异显示聚合酶链反应技术（restriction fragment differential display PCR,RFDD-PCR）应用于日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫基因的研究。建立了免疫处理后的日本七鳃鳗血液类淋巴细胞的基因表达谱,获得基因片段1683个,其中与正常饲养日本七鳃鳗血液类淋巴细胞有表达差异的片段为97个,占表达数的5.76%。初步分析比较在混合抗原特异性免疫刺激条件下,日本七鳃鳗类淋巴细胞差异表达基因的特征,97条差异条带中有64条（约66.9%）序列能够通过同源比对获得其生物学功能信息,大致分为8类,包括初级代谢、蛋白质合成、转录、能量代谢、细胞结构、信号转导、细胞凋亡、免疫防卫等功能。其中属免疫防卫功能的基因有13条,约占差异数的20.3%,并筛选出2条特异性免疫相关的候选基因VLR,与海七鳃鳗的VLR基因有很高的同源相似性。同时得到一些可能是新基因的候选片断,有待进一步研究证实。通过差异片段的分析来推断和研究无颌类适应性免疫系统产生的机理与发生机制,为进一步研究提供线索。
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摘要Abstract第一章 文献综述1.1 无颌类脊椎动物免疫器官的进化1.2 无颌类脊椎动物淋巴细胞的进化1.3 无颌类脊椎动物免疫相关因子的研究1.3.1 T 细胞受体（TCR）和CD41.3.2 B 细胞受体1.3.3 可变淋巴受体（VLR）1.3.4 其他免疫因子1.4 无颌类脊椎动物适应性免疫机制1.5 限制片段差异显示聚合酶链反应在基因差异表达方面的研究1.6 讨论第二章 日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离，纯化及细胞学特征2.1 日本七鳃鳗类淋巴细胞的分离、纯化2.1.1 材料与方法2.1.1.1 材料2.1.1.2 方法2.1.2 结果2.1.2.1 日本七鳃鳗全血细胞的观察2.1.2.2 外周血单个核细胞的密度梯度分离效果2.1.2.3 类淋巴细胞的流式细胞仪分选2.1.2.4 类淋巴细胞的透射电镜观察2.2 日本七鳃鳗类淋巴细胞的异质性分析2.2.1 材料与方法2.2.1.1 材料2.2.1.2 方法2.2.2 结果2.2.2.1 日本七鳃鳗的类淋巴细胞的ANAE 染色观察2.2.2.2 日本七鳃鳗的类淋巴细胞的体外转化2.3 讨论第三章 RFDD-PCR 方法分析日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的差异表达3.1 混和抗原免疫刺激日本七鳃鳗3.1.1 材料与方法3.1.1.1 材料3.1.1.2 混和抗原的制备3.1.1.3 免疫刺激日本七鳃鳗3.2 RFDD-PCR 方法建立日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因差异表达谱3.2.1 材料与方法3.2.1.1 材料3.2.1.2 主要试剂3.2.1.3 其他耗材3.2.1.4 主要设备3.2.1.5 方法3.2.2 结果3.2.2.1 类淋巴细胞RNA 浓度及完整性3.3 日本七鳃鳗类淋巴细胞差异表达基因的生物学分析3.3.1 方法3.3.2 结果3.3.2.1 免疫处理日本七鳃鳗血液类淋巴细胞的电泳条带数目统计3.3.2.2 差异基因的功能分类3.3.2.3 可变淋巴受体基因的同源基因3.4 讨论第四章 全文总结4.1 成功分离和纯化日本七鳃鳗的类淋巴细胞，并确定其单个核细胞层的最佳分离液比重为1.0924.2 从细胞形态和组织化学研究等侧面分析了七鳃鳗类淋巴细胞的异质性4.3 RFDD-PCR 方法建立日本七鳃鳗类淋巴细胞特异性免疫相关基因的表达谱并筛选得到VLR 同源基因参考文献附录附录1. 免疫处理日本七鳃鳗血液类淋巴细胞的聚丙烯酰胺凝胶电泳图附录2. 差异条带测序结果发表论文致谢
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