苏云金芽胞杆菌AHL内酯酶功能及其抗魔芋软腐病研究

论文摘要

本文主要研究了苏云金芽胞杆菌AHL内酯酶的抗病功能和其本身在苏云金芽胞杆菌中的调控功能。主要研究结果如下： 1 苏云金芽胞杆菌中AHL内酯酶的抗病活性检测 通过对苏云金芽胞杆菌不同菌株的抗病活性进行检测，发现各菌株之间对大白菜软腐病菌SCG1的致病性抑制活性存在较大差异。从抗病活性较高菌株H38和H42中克隆aiiA基因并在大肠杆菌中表达，表达的AHL内酯酶也能较强抑制大白菜软腐病菌SCG1的致病作用。另外，对这种蛋白的潜在防治对象进行调查时发现植物病原细菌中除了黄单胞杆菌中AHL信号较弱外，其余菌株均有较强的AHL信号存在；在革兰氏阳性细菌和真菌中没有检测到AHL信号分子。 2 抗病苏云金芽胞杆菌工程菌的田间应用 利用抗病工程菌株BMB686和BMB3439于2003年、2004年及2005年连续3年对魔芋新区与老区进行灌根防治试验，同时以化学农药作为对照。结果表明：抗病工程菌株在老区的相对防效可达32—40％，在新区的相对防效可达40—45％；化学农药在魔芋软腐病发病盛期的最高相对防效只有50％左右，绝大部分化学农药的相对防效为40％或更低。 3 aiiA基因的改造及转化花魔芋 依据魔芋的密码子偏爱性改造aiiA基因，构建转化花魔芋的双元载体，利用优化的花魔芋组织培养与再生体系转化花魔芋，潮霉素标记的合适筛选压前期为22.5mg／L，后期为37.5mg／L，抗性苗经PCR检测确定该基因已成功转化到花魔芋中。 4 AHL内酯酶在苏云金芽胞杆菌中的调控功能研究 苏云金芽胞杆菌中以下生理现象与AHL内酯酶的表达水平有关：1)在LB培养基中，提高AHL内酯酶的表达量会缩短细菌的代时；当在LB培养基中添加体积比为2％或4％的乙醇时，苏云金芽胞杆菌的代时会随着AHL内酯酶的表达量提高而大大延长。2)在37℃培养时，AHL内酯酶的表达水平与苏云金芽胞杆菌黑色素的产量呈正相关。3)在swarming评价盘中于28℃恒温保湿条件下培养48h后，AHL内酯酶的表达水平与细菌的swarming能力呈负相关。4)AHL内酯酶的表达水

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 细菌群体感应调节系统
• 1.1.1 革兰氏阴性细菌中的群体感应调节系统
• 1.1.3 革兰氏阳性细菌中群体感应调节系统
• 1.1.4 感知细菌种间的群体感应调节系统
• 1.1.5 细菌群体感应调节系统在病害防治中的作用
• 1.2 AHL信号分子降解酶的研究进展
• 1.2.1 降解 AHL信号分子的内酯酶
• 1.2.2 降解 AHL信号分子的酰胺酶
• 1.2.3 AHL信号分子的其它降解方式
• 1.3 魔芋软腐病
• 1.3.1 魔芋概述
• 1.3.2 魔芋用途
• 1.3.3 魔芋软腐病
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 PCR引物
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 各种抽提液
• 3.1.6 仪器
• 3.1.7 供试植物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 核酸水平操作
• 3.2.2 重组质粒的转化
• 3.2.3 大肠杆菌转化子的快检
• 3.2.4 蛋白的SDS-PAGE
• 3.2.5 aiiA基因的克隆和表达
• 3.2.6 aiiA基因突变菌株的筛选
• 3.2.7 苏云金芽胞杆菌孢子悬浮液的制备
• 3.2.8 苏云金芽胞杆菌黑色素测定
• 3.2.9 苏云金芽胞杆菌对乙醇耐受性测定
• 3.2.10 细菌代时的计算
• 3.2.11 苏云金芽胞杆菌Swarming motility测定
• 3.2.12 细菌AHL内酯酶活性测定
• 3.2.13 软腐病菌致病性测定
• 3.2.14 试验地选择与小区设置处理
• 4 结果与分析
• 4.1 AHL内酯酶的抗病功能
• 4.1.1 苏云金芽胞杆菌抗病活性的检测
• 4.1.2 aiiA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
• 4.1.3 大肠杆菌表达AHL内酯酶的活性检测
• 4.1.4 真菌与细菌中AHL信号分子的检测
• 4.1.5 抗病工程菌BMB686对魔芋软腐病的防效
• 4.1.6 抗病工程菌BMB3439对魔芋软腐病的防效
• 4.2 aiiA基因转化魔芋研究
• 4.2.1 花魔芋愈伤组织形成与植株再生条件研究
• 4.2.2 农杆菌双元表达载体的构建
• 4.2.3 农杆菌介导的魔芋转化系统
• 4.3 苏云金芽胞杆菌中AHL内酯酶的功能
• 4.3.1 苏云金芽胞杆菌中AHL内酯酶不同表达水平菌株的构建
• 4.3.2 AHL内酯酶的表达水平对苏云金芽胞杆菌耐受乙醇的影响
• 4.3.3 AHL内酯酶的表达水平对苏云金芽胞杆菌黑色素产量的影响
• 4.3.4 AHL内酯酶的表达水平对苏云金芽胞杆菌群游的影响
• 4.3.5 AHL内酯酶的表达水平对苏云金芽胞杆菌生长发育的影响
• 4.3.6 AHL内酯酶的表达水平对aiiA两侧基因转录水平的影响
• 4.4 苏云金芽胞杆菌中AI-2信号分子的检测
• 4.4.1 AI-2信号分子合成酶的检测与克隆
• 4.4.2 AI-2信号分子的检测
• 5 讨论
• 6 总结
• 参考文献
• 致谢
• 博士生期间已发表的论文