论文摘要
【背景】随着生活水平的提高、生活方式的改变和人口的老龄化，糖尿病患病率在世界范围内呈现出上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一严重危害大众健康的慢性非传染性疾病。目前全球已诊断的糖尿病患者超过1.5亿人，预测到2025年将增至3亿人。糖尿病合并严重感染是糖尿病最常见的并发症之一。在应用胰岛素治疗以前，感染是糖尿病的主要死因，直至二十世纪五十年代，糖尿病患者仍有较高的死亡率。近年来，随着胰岛素和抗生素的应用，糖尿病并发感染的死亡率有所下降，但仍占糖尿病死亡原因第二位。糖尿病患者的感染发生率高达36.8％，并仍有上升的趋势。因此，有效地防治感染对于降低糖尿病患者的死亡率非常重要。目前认为糖尿病患者易并发各种感染，主要与高血糖状态、机体防御机能减弱、糖尿病的并发症、营养不良等因素有关，其中比较受关注的是机体防御机能减弱。控制不良或伴酮症酸中毒的糖尿病患者常同时有多种防御机能缺陷，对入侵微生物的的各反应阶段都被抑制，从而极易感染，且程度严重。白细胞在抗感染方面发挥着重要作用。它参与机体非特异性免疫和特异性免疫过程，有吞噬、杀死病原体的作用，是机体抗感染的第一道防线。许多研究对糖尿病患者白细胞吞噬杀菌功能进行了研究，发现血糖控制差的糖尿病患者，中性粒细胞的趋化、粘附、吞噬及氧化杀菌等功能均较正常人低，且与病情控制及代谢紊乱的程度有关。多数糖尿病患者白细胞的超微结构亦有异常。近年来，对糖尿病患者白细胞吞噬杀菌功能降低机制的研究越来越重视，国内外很多学者分别从糖尿病患者白细胞膜脂流动性、胞内碱性磷酸酶活力、溶酶体酶、调理素、Ca2+浓度、山梨醇及肌醇代谢状态等方面进行了研究，但仍无定论。呼吸爆发是白细胞激活后行使杀菌功能的主要途径。NADPH是呼吸爆发的必需物质，它的生成有赖于细胞内磷酸戊糖途径（PPP）的关键酶——葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的活性正常。对G6PD的研究早在上世纪80年代就已进入DNA水平，研究主要集中在G6PD缺乏症基因突变方面。近年来，美国哈佛大学医学院Joslin糖尿病中心研究发现G6PD与糖尿病肾病、血管内皮细胞功能等均存在密切联系。目前认为，G6PD不仅与白细胞呼吸爆发功能，与糖尿病及其并发症均存在密切关系。本研究将采用含不同浓度葡萄糖培养液离体培养的健康成人外周血白细胞及符合ADA 1997年诊断标准的糖尿病患者外周血白细胞作为研究对象，观察细胞周围环境中葡萄糖浓度对其呼吸爆发功能的影响。研究分为以下两部分进行：第一章不同浓度葡萄糖培养正常人离体白细胞的呼吸爆发功能研究【目的】探讨正常人离体外周血白细胞经不同葡萄糖浓度培养后，在不同时间点，白细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性的改变，及其对白细胞呼吸爆发功能的影响。【方法】1．以分离出来的健康成人外周血白细胞为实验对象，分别用5mM，15mM，25mM浓度的D-葡萄糖培养液培养（5mM组、15mM组、25mM组），20mML-葡萄糖+5mM D-葡萄糖培养为高渗对照组（L-GLU组），每组6例。2．分别在10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h共9个不同的培养时间点，用分光光度法检测白细胞内G6PD的活性及NADPH的含量，用荧光探针法检测细胞内ROS产量。3．实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS10.0软件进行统计分析，采用连续性重复测量的方差分析。同时考虑处理分组和重复测量的时间点两个因素，同时兼顾主效应和交互效应的影响。检验标准α定为0.05。【结果】1．正常人白细胞G6PD活性及NADPH含量在不同浓度葡萄糖培养时均表现为早期相（即10min、20min、30min、1h和2h五个时间点）无显著变化。25mM组在培养4h时开始出现G6PD活性及NADPH含量的下降，15mM组在培养8h时出现下降，均与培养时间呈负相关（分别为r=-0.803 P＜0.001 N=54和r=-0.879 P＜0.001 N=54）。5mM组及L-GLU组均未见G6PD活性及NADPH含量随时间的改变。2．从4h时间点开始，25mM组的G6PD活性及NADPH含量与15mM组、5mM组及L-GLU组相比，均存在显著差异（P＜0.01）。从8h时间点开始，15mM组的G6PD活性及NADPH含量与25mM组、5mM组及L-GLU组相比，差异显著（P＜0.01）。3．除L-GLU组外，不同浓度葡萄糖组在培养10min、20min、30min时白细胞内ROS产量随培养液葡萄糖浓度的升高而增加。从1h时间点开始，15mM组及25mM组白细胞内ROS产量均随着NADPH的含量及G6PD活性的下降而降低。5mM组及L-GLU组G6PD活性、NADPH含量及ROS产量均无明显改变（P＞0.05）。4．四组的NADPH含量与G6PD活性均呈正相关关系，相关系数分别为（r=0.690 P＜0.001 N=54）、（r=0.868 P＜0.001 N=54）、（r=0.870 P＜0.001 N=54）、（r=0.803 P＜0.001 N=54）。【结论】1．高糖的培养环境对离体培养的白细胞是一个刺激因素，葡萄糖浓度越高对白细胞呼吸爆发的影响越明显。在刺激早期G6PD活性无改变，细胞ROS产量随着刺激强度的加大而增加。2．持续的高糖刺激可明显降低白细胞G6PD活性，影响NADPH的产量。3．白细胞NADPH含量与G6PD活性的变化一致，并直接影响ROS产量，影响呼吸爆发功能的发挥。第二章糖尿病患者外周血白细胞呼吸爆发功能研究【目的】检测在不同的血糖控制情况下，2型糖尿病患者外周血白细胞的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性、G6PDmRNA表达及白细胞呼吸爆发功能的变化。对G6PD与糖尿病白细胞呼吸爆发功能改变的关系和可能机制进行初步探讨。【方法】1．以符合WHO 1997年诊断标准的2型糖尿病患者20例为研究对象，按糖化血红蛋白水平分为两个亚组，HbAlc≤7.0％（G1组）和HbAlc＞7.0％（G2组）；健康成年人10例为对照组（NC组）。2．分离外周血白细胞，用分光光度法检测白细胞内的G6PD活性、NADPH含量；用荧光探针法测定ROS的含量；用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测白细胞G6PDmRNA。3．实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS10.0软件进行统计分析。两样本计量资料比较采用t检验。多组间资料比较用单因素方差分析（one-way ANOVA）。检验标准α定为0.05。【结果】1．G1组患者外周血白细胞G6PD活性、NADPH及ROS含量与正常对照组相比均显著下降（P＜0.01）。2．G2组白细胞G6PD活性、NADPH及ROS含量与G1组相比呈进一步下降，差异显著（P＜0.01）。3．相关性分析：白细胞G6PD活性、NADPH及ROS含量均与HbAlc水平呈负相关（r=-0.757 P＜0.01 n=30）（r=-0.671 P＜0.01 n=30）（r=-0.814 P＜0.01 n=30）。4．外周血白细胞G6PDmRNA表达水平G2组最高。G1组和G2组分别与NC组相比，均差异显著（P＜0.01），G1组与G2组相比亦呈显著差异（P＜0.01）。【结论】1．与健康成人相比，2型糖尿病患者外周血白细胞G6PD活性、NADPH及ROS含量均明显降低，提示2型糖尿病患者白细胞呼吸爆发功能障碍，与其G6PD活性降低有关。2．2型糖尿病患者中，血糖控制不佳的患者与血糖控制良好的患者相比，其G6PD活性、NADPH及ROS含量的下降幅度更大，提示血糖控制不良引起糖尿病G6PD活性下降是导致其白细胞呼吸爆发功能障碍的重要因素。3．与健康成人相比，2型糖尿病患者外周血白细胞G6PDmRNA表达增加，并与糖化血红蛋白水平呈正相关，提示2型糖尿病患者白细胞G6PD活性降低的原因并非其表达减少，相反机体因此出现了代偿性表达升高。