南方鲇POMC、TSHβ亚基和SL cDNA克隆及垂体激素基因的时空表达

论文摘要

运用RT-PCR和RACE技术克隆了南方鲇阿黑皮素原（POMC）、促甲状腺激素β亚基（TSHβ）和生长乳素（SL）全长cDNA,并通过RT-PCR方法研究了南方鲇垂体激素的组织分布和个体发生,通过cRNA探针原位杂交研究了南方鲇垂体的结构和发生,建立了南方鲇垂体激素的时空表达模式,弄清南方鲇垂体的图式形成过程,为深入研究鱼类垂体激素的生理功能、垂体发育的调控奠定了基础。南方鲇POMC cDNA全长1003bp,包括135bp的5’UTR、229bp的3’UTR、编码28个氨基酸残基的信号肽和184个氨基酸残基的成熟肽的639bp的ORF。对已公开的POMC氨基酸序列的相似性分析表明:南方鲇POMC与斑点叉尾鮰的相似性最高,达84%,与其他硬骨鱼类和软骨鱼类的相似性分别为41.2～66.7%和29.2～29.7%,与两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的相似性为31.2～41.9%,与人的为37.1%。其ACTH、α-MSH和β-END功能区高度保守,ACTH功能区与软骨鱼类和包括人在内的其他脊椎动物的相似性分别为52.1～67.6%和69.8～94.2%。α-MSH功能区除与牛、白斑角鲨、赤魟、澳大利亚虎鲨和银鲛存在一个氨基酸的差异外,与其他物种的相同。β-END与其他脊椎动物的相似性为58～83.9%。南方鲇TSHβ亚基cDNA全长640bp,其中5’UTR 53bp,3’UTR 152bp,ORF 435bp,编码19个氨基酸残基组成的信号肽和135个氨基酸残基组成的成熟肽。其氨基酸序列与鲤形目、鲈形目和鲑形目鱼类的相似性较高,达55.5～65.3%,与澳洲肺鱼的相似性最低,为35.0%,与人和其他脊椎动物的相似性为39.1～44.4%,南方鲇TSHβ亚基与其GTHα亚基、LHβ亚基和FSHβ亚基的相似性分别为16.4%、29.9%和42.4%。南方鲇TSHβ亚基具垂体糖蛋白激素家族成员保守的12个半胱氨酸残基和N-糖基化位点。南方鲇不同组织中SL由于基因的选择性剪切表达不同的mRNA,即垂体表达SL1、SL2,胰腺、脾脏、肾、头肾、鳃、动脉球、端脑、间脑和嗅球表达SL3。SL1 cDNA全长863bp,其5’UTR长24bp,3’UTR长140bp,ORF长699bp,编码27个氨基酸残基的信号肽和205个氨基酸残基的成熟肽,与已公开的其他鱼类的SL氨基酸残基数目相似,与斑点叉尾鮰SL的相似性为84%,与其他鱼类的相似性仅37.6～53.9%。值得注意的是南方鲇SL1和斑点义尾鮰SL与Zhu等（2004）划分的SLβ类群和SLα类群的相似性均较低。系统进化分析亦表明鲇形目SL与SLα类群聚在一起,位于进化树的根部。因此,鲇形目SL的系统进化有待研究。SL2cDNA全长766bp,5’UTR 24bp,3’UTR 250bp,ORF 492bp,编码27个氨基酸残基组成的信号肽和136氨基酸残基组成的成熟肽。SL3 cDNA全长978bp,5’UTR 24bp,3’UTR 399bp,ORF 555bp,编码27个氨基酸残基的信号肽和157个氨基酸残基的成熟肽。对南方鲇SL1、SL2和SL3核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的比较分析发现,SL2 cDNA缺失了SL1 cDNA从G429到G525的97bp,SL3 cDNA在SL1 cDNA的G525和A526间插入了115bp。推导的氨基酸序列的比较分析发现,SL2和SL3缺失了SL1保守的C-端3个半胱氨酸残基,并完全缺失了PRL/GH/SL家族4个保守结构域中的SLD,SL2还缺失了SLC。南方鲇不同组织中不同SL基因剪切产物的表达,可能与其在不同组织中具不同的生理功能有关。该发现为研究鱼类SL的生理功能这一热点问题提供了新的线索。POMC在垂体和间脑高量表达,在食道、贲门、胰脏、头肾、鳃、中脑和嗅球低量表达。GH除在垂体表达外,食道、贲门、幽门、前肠、中肠、后肠、肝脏、胰脏、脾脏、鳃、卵巢、精巢、心房、心室、动脉球、小脑、嗅囊亦有GH的表达。TSHβ亚基在垂体、贲门、幽门、前肠、胰脏、脾脏、头肾、鳃、心房、心室、皮肤、端脑、中脑、嗅球表达。南方鲇不同组织中表达SL基因不同的剪切产物,SL1在垂体、中肠、后肠、肝脏表达,SL3在食道、胃体、幽门、前肠、胰脏、脾脏、肾、头肾、鳃、精巢、心房、心室、嗅球表达,贲门、卵巢、肌肉、端脑、间脑、中脑、小脑、延脑和嗅囊表达SL1和SL3。垂体激素在垂体外组织中表达,表明这些部位产生的垂体激素可通过自分泌或旁分泌参与生命活动的调节,SL的不同剪切产物在不同组织中表达,暗示其在不同组织中发挥不同的生理功能。本文首次在鱼类运用物种特异性的各种垂体激素cRNA探针,对鱼类垂体的结构进行了系统的研究。南方鲇垂体与其他鱼类一样,具ACTH、PRL、GH、FSH、LH、TSH、SL和MSH 8种激素分泌细胞。ACTH细胞位于RPD与神经垂体及神经分枝的交界处,在PPD也有分布。PRL细胞是RPD的主要细胞类型,PPD和PI也有少量分布。GH细胞、FSH细胞和LH细胞遍布PPD各处,三者混杂,在RPD的背腹边缘和PI后缘也有分布。MSH细胞是PI的主要细胞类型,被PI中发达的神经分枝分隔成众多岛状的细胞群,在PPD中亦分散存在。SL细胞位于PI MSH细胞团的外围,神经分枝的周围,RPD和PPD也有分布。TSH细胞主要位于PI前部靠PPD处,PPD各处和RPD背、腹侧边缘也有少量的TSH细胞。对南方鲇幼鱼和成鱼FSH细胞和LH细胞的比较研究,发现幼鱼和成鱼均具FSH和LH细胞,且幼鱼LH细胞数量大于FSH细胞,表明南方鲇FSH和LH均在性腺发育的早期发挥作用,促进精子的生成和卵黄物质的合成,且LH起着主导的作用,有别于绝大多数鱼类FSH在精子生成和卵黄生成阶段起主导作用,而LH主要在性腺成熟的晚期发挥作用,促进卵母细胞的最后成熟并刺激排卵。本文首次发现鱼类垂体神经分泌纤维间存在具有分泌激素能力的细胞,即PI神经分泌纤维间呈POMC阳性的大型泡状细胞和RPD背腹侧、PPD和PI神经分泌纤维间纺锤形TSH细胞,且POMC阳性大型泡状细胞的分泌活动与性腺发育密切相关。南方鲇垂体激素个体发生的RT-PCR研究发现:受精后8.5h,胚胎发育至原肠早期,PRL基因开始表达。受精后17.5h,原肠晚期时POMC基因开始表达。受精后28.5h,TSHβ亚基基因开始表达。GTHα亚基、GH和SL基因分别于出膜后6h、12h和20h开始表达。且出膜80h以后幼鱼不仅表达SL1,而且表达SL3。垂体发生的原位杂交研究发现:受精后38.5h,间脑腹面的前部开始出现线状排列的PRL细胞;受精后40.5h,PRL细胞逐渐向中轴方向迁移,呈左右对称的两团位于间脑腹面的前方;受精后42.5h,PRL细胞随口凹的出现开始向后方迁移;受精后44.5h,PRL细胞汇聚成间脑腹面前下方密集的细胞团,切片观察发现,除边缘少数细胞PRL阴性外,绝大部分区域为PRL阳性细胞占据;受精后47.5h,初孵仔鱼PRL细胞位于腺垂体原基的前部。受精后44.5h,POMC细胞开始出现,呈左右对称的两团位于间脑腹面的前下方;出膜后32h,POMC细胞在间脑腹面中央聚集;切片观察发现:受精后47.5h,初孵仔鱼POMC细胞主要位于间脑腹面漏斗体的前方,腺垂体原基前部腹方仅有零星的POMC细胞分布;出膜后32h,POMC细胞数量少,遍布垂体各处;出膜后44h,垂体中POMC细胞数量剧增;出膜后104h,RPD中神经垂体周围POMC细胞呈索状排列,为ACTH细胞。出膜后12h,GH细胞在垂体中部分化出现;之后在垂体的背、腹侧向前、后延伸。出膜后12h,GTHα亚基在垂体腹面后方的少数细胞中开始表达;出膜后56h,GTHα亚基阳性细胞主要位于垂体中、后部。出膜后32h,最早分化的SL细胞位于垂体后部,之后向垂体中部延伸。出膜后80h,TSHβ亚基阳性细胞同GTHα亚基阳性细胞一样,在垂体腹面后方开始出现,之后向垂体中部腹面延伸。出膜后128h,LHβ亚基阳性细胞开始分化,直至出膜后30d,LHβ亚基阳性细胞始终位于垂体后部。出膜后30d尚未观察到FSHβ亚基阳性细胞。以上研究表明:南方鲇腺垂体原基起源于胚胎前神经嵴中线处的基板外胚层,呈左右对称型。受精后38.5h,腺垂体原基中左右排列的一列细胞首先分化为PRL细胞;之后PRL细胞随腺垂体原基向中轴方向汇聚;受精后44.5h,PRL细胞汇聚成一团,位于间脑腹面的前下方,腺垂体原基由绝大多数的PRL细胞和少数的PRL阴性细胞组成,此时间脑腹面两侧的部分细胞中POMC基因开始表达;受精后47.5h（初孵仔鱼）,腺垂体原基后部的细胞大量增殖,将来发育形成PPD和PI,原基前部为PRL细胞和零星分布的POMC阳性细胞;以后腺垂体原基前部的PRL和POMC阳性细胞数量增加,出膜后104h,RPD中POMC阳性细胞位于神经垂体周围,与成鱼ACTH细胞的位置一致。PPD利PI中POMC阳性细胞直接由腺垂体原基中部和后部的细胞分化形成。GH细胞首先在腺垂体原基的中部分化,之后再向垂体背、腹面的前、后缘延伸。TSH细胞、SL细胞和GTH细胞首先由腺垂体原基后部的细胞分化,之后逐渐延伸至垂体的中部。垂体激素细胞的空间分布格局逐渐形成。与斑马鱼垂体图式形成过程进行比较,发现二者在腺垂体原基早期空间分布格局上存在明显的差异。有关鱼类垂体的图式形成过程尚有待深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 南方鲇POMC、TSHβ和SL全长cDNA克隆和序列分析
• 1.1 前言
• 1.1.1 POMC基因的结构、进化及POMC编码激素的功能
• 1.1.2 TSHβ亚基的结构和TSH的功能
• 1.1.3 SL的结构与生理功能
• 1.2 实验动物
• 1.3 材料和方法
• 1.3.1 实验试剂
• 1.3.2 南方鲇POMC、TSHβ和SL cDNA序列的克隆
• 1.3.3 南方鲇POMC、TSHβ和SL序列分析
• 1.4 结果
• 1.4.1 南方鲇POMC全长cDNA克隆及序列分析
• 1.4.2 南方鲇TSHβ亚基全长cDNA的克隆与序列分析
• 1.4.3 南方鲇SL全长cDNA的克隆与序列分析
• 1.5 讨论
• 1.5.1 南方鲇POMC的特点及POMC在系统发生中的作用
• 1.5.2 垂体糖蛋白激素家族基因的进化与脊椎动物TSHβ亚基的多样性
• 1.5.3 鲇形目鱼类SL在SL基因进化中所处的位置
• 1.5.4 南方鲇SL的多样性
• 1.6 结论
• 第二章 南方鲇垂体激素的组织表达及垂体的原位杂交
• 2.1 前言
• 2.1.1 垂体激素在垂体外组织中的表达及其可能发挥的作用
• 2.1.2 鱼类垂体的结构
• 2.2 实验动物
• 2.3 材料、方法
• 2.3.1 实验试剂
• 2.3.2 垂体激素的组织表达
• 2.3.3 地高辛标记RNA探针的合成
• 2.3.4 原位杂交
• 2.3.5 对照
• 2.3.6 部分试剂的配制
• 2.4 结果
• 2.4.1 南方鮎POMC、GH、TSHβ亚基和SL的组织分布
• 2.4.2 南方鲇pGEM-T/POMC、pGEM-T/PRL、pGEM-T/GH、pGEM-T/GTHα、pGEM-T/FSHβ、pGEM-T/LHβ、pGEM-T/TSHβ和pGEM-T/SL重组质粒的构建
• 2.4.3 南方鮎垂体的结构
• 2.5 讨论
• 2.5.1 南方鮎POMC的组织分布
• 2.5.2 南方鮎SL的组织表达
• 2.5.3 南方鮎垂体的结构特点
• 2.5.4 南方鮎垂体中POMC阳性细胞的种类
• 2.5.5 南方鮎两种GTH细胞及其在生殖调控中的作用
• 2.5.6 南方鲇RPD、PPD和PI神经分泌纤维间GTHα和TSHβ阳性细胞
• 2.6 结论
• 第三章 南方鲇垂体激素基因的时间表达模式及垂体发生的原位杂交研究
• 3.1 前言
• 3.1.1 垂体器官发生的时空模式
• 3.1.2 垂体发育调控的分子机制
• 3.1.3 GTH细胞发生与性腺分化的关系
• 3.1.4 垂体激素在胚胎发育中的作用
• 3.2 实验动物
• 3.3 材料、方法
• 3.3.1 实验试剂
• 3.3.2 垂体发生过程中激素表达的RT-PCR
• 3.3.3 原位杂交
• 3.4 结果
• 3.4.1 南方鮎垂体激素基因表达的时间模式
• 3.4.2 南方鮎垂体的发生
• 3.5 讨论
• 3.5.1 南方鲇垂体激素细胞分化的时序
• 3.5.2 南方鮎垂体的图式形成过程
• 3.5.3 南方鮎FSH和LH细胞的发生及其与性腺分化的关系
• 3.6 结论
• 参考文献
• 图版及说明
• 致谢