β-淀粉样蛋白上调人脸微血管内皮细胞CCR5表达的机制及意义

论文摘要

目的在老年人中,阿尔茨海默氏病（AD）是痴呆发生最为常见的原因,在美国人的死因中占第四位。它的临床特征包括进行性的痴呆,渐进的认知能力下降。它主要的神经病理特征包括老年斑、神经纤维缠结及神经元和突起的丢失。老年斑和脑血管内沉积的主要成份是β-淀粉样蛋白（Aβ）,它由39-43个氨基酸残基组成,是淀粉样蛋白的前体蛋白经过剪切形成。Aβ的聚集被认为极可能是AD早期的必要因素。脑血管功能失调促进AD认知能力下降和痴呆的发生。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、内基膜和神经胶质膜构成,是脑和循环系统之间的一个代谢和生理性屏障结构,血脑屏障的功能在于阻止循环中的药物、毒素等外源物质入脑以保护中枢神经系统免受损害。体外分离培养的人脑微血管内皮细胞（HBMECs）就成为研究血脑屏障功能的理想对象。近年的越来越多的证据表明,炎症机制在AD发病机制中起着至关重要的作用。趋化因子属于细胞因子家族,主要功能是募集单核细胞到炎症部位。趋化因子受体5（CCR5）是一种趋化因子的受体,免疫组织化学研究表明,AD病人Aβ的沉积伴随活化的胶质细胞中CCR5表达增加,这提示CCR5在调节AD病人的免疫反应中发挥作用。在我研究室以前的研究中,发现Aβ能够上调HBMECS表面的CCR5蛋白表达,但其机制和意义并不清楚,本研究试图回答该问题。血脑屏障（BBB）通过内皮细胞上的晚期糖基化末端产物受体（RAGE）和低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP-1）运输Aβ。RAGE是细胞表面分子免疫球蛋白超家族的一员,能够与Aβ相互作用,是与AD发病相关的一个重要蛋白。在构成血脑屏障的内皮细胞上,Aβ与RAGE相互作用引起循环中的Aβ通过跨细胞作用进入脑内。在AD病人的脑内,RAGE的表达增加,使得进入脑内的Aβ增加并且在脑内聚集,这与AD的发病机制相关。近年证实RAGE存在几种亚型,它们编码缺少了跨膜和胞浆段的截短的RAGE,这些分泌型的RAGE能够与RAGE的配体结合,抑制RAGE的配体和受体相互作用,进而抑制配体/受体轴的信号传递,这为我们寻找预防和治疗AD的有效方法提供一些新的思路。那么Aβ是通过什么信号通路上调HBMECs上的CCR5表达?CCR5表达上调有什么重要的生物学意义呢?运输循环系统中Aβ进入中枢神经系统（CNS）的RAGE是否参与了CCR5表达上调的过程呢?这些问题与AD病人的发病机制密切相关,解决上述问题可望为我们寻找预防和治疗AD病人的医疗方案积累一定的理论基础。因此,本文主要针对解决上述问题展开相关的实验。方法一、研究Aβ上调HBMECs上CCR5表达的细胞内分子机制（一）细胞培养HBMECS培养于含10%胎牛血清和10%新生牛血清的RPMI1640培养液。（二）荧光实时定量PCR法检测不同浓度和不同时间的Aβ对HBMECs上CCR5 mRNA表达的影响。（三）Western-blot方法检测不同浓度和不同时间的Aβ对HBMECs上CCR5蛋白表达的影响。（四）Western-blot方法检测Aβ对MAPK/PI3K信号通路的影响。（五）Western-blot方法检测Aβ对HBMECs上Egr-1表达的影响。（六）染色质免疫沉淀法检测转录因子Egr-1与CCR5启动子的结合情况。（七）建立Egr-1干扰的HBMECs细胞株Egr-1 siRNAs稳定转染HBMECs的细胞株,并用western-blot方法鉴定及检测CCR5的表达情况。二、探讨RAGE受体在Aβ上调HBMECs表面CCR5表达过程中的作用（一）应用RT-PCR方法分析不同浓度和不同时间Aβ对HBMECs上RAGE mRNA表达的影响。（二）应用Western-blot方法分析不同浓度和不同时间Aβ对HBMECs上RAGE蛋白表达的影响。（三）应用Western-blot方法检测RAGE中和抗体对Aβ通过MAPK/PI3K信号分子上调CCR5表达的影响。（四）真核表达载体构建,脂质体稳定转染HBMECs,建立过表达RAGE的HBMECs细胞株(即HBMECRAGE+)。1、重组质粒pUCmT-RAGE的构建。2、真核表达载体构建。3、稳定转染HBMECs细胞株。（五）真核表达载体构建及稳定转染细胞方法建立RAGE胞内段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECC-truncated RAGE)和RAGE胞外段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECN-truncated RAGE)。方法同上（六）应用Western-blot方法检测Aβ对HBMECRAGE+、HBMECC-truncated RAGE和HBMECN-truncated RAGE上CCR5的蛋白表达的影响,同时检测后两种转染了截短型RAGE细胞中MAPK和AKT信号分子的表达情况。三、研究Aβ上调CCR5表达对T淋巴细胞入脑的影响（一）使用试剂盒分离AD病人外周血T淋巴细胞。（二）跨内皮迁移实验分析AD病人外周血T淋巴细胞、6T-CEM细胞和Jurkat细胞穿过正常HBMEC单层及各种转染的HBMEC单层的情况。1、Aβ上调CCR5表达与T淋巴细胞穿过HBMEC单层相关。（1）不同浓度的Aβ对6T-CEM细胞、AD病人外周血T淋巴细胞和Jurkat细胞穿过HBMECS单层的影响。（2）6T-CEM细胞、AD病人外周血T淋巴细胞和Jurkat细胞穿过CCR5缺失突变的HBMECs(即HBMECCCR5-)和CCR5过表达的HBMECs(即HBMECCCR5+)单层的情况。（3）Aβ对6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过CCR5缺失突变的HBMECs(即HBMECCCR5-)的影响。2、RAGE受体参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。（1）RAGE中和抗体对6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMEC单层的影响。（2）Aβ对6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞和JURKT细胞穿过过表达RAGE的HBMECs(即HBMECRAGE+)单层的影响。（3）Aβ对6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过RAGE胞内段缺失的HBMECs(即HBMECC-truncated RAGE)单层和RAGE胞外段缺失的HBMECs(即HBMECN-truncated RAGE)单层的影响3、MPAK信号分子参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。（1）通过脂质体转染法将JNKsiRNAs和ERKsiRNAs分别瞬时转染HBMECs,用Western-blot法鉴定转染细胞中JNK和ERK的表达情况,以及加入Aβ后CCR5的表达情况。（2）通过脂质体转染法将JNKsiRNAs和ERKsiRNAs瞬时转染到Transwell上室接种的HBMEC单层内。（3）检测6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过JNK和ERK干扰后的HBMEC单层的情况。4、PI3K/AKT信号分子参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。（1）Western-blot方法:检测PI3K缺失突变的HBMECs（即PI3K/△P110）上CCR5的表达情况。（2）Aβ对6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过PI3K/△P110的HBMEC单层的影响。5、Egr-1参与T淋巴细胞穿过HBMEC单层的过程。Aβ对6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过Egr-1干扰后的HBMEC单层的影响。结果一、Aβ通过MAPK/PI3K信号分子上调CCR5的表达（一）Aβ上调HBMECs上CCR5 mRNA的表达具有时间和浓度依赖性Aβ作用1个小时CCR5 mRNA表达最多,125nM浓度的Aβ上调CCR5 mRNA表达最多。（二）Aβ上调HBMECs上CCR5蛋白的表达具有时间和浓度依赖性Aβ作用2个小时CCR5蛋白表达最多;125nM浓度的Aβ上调CCR5蛋白表达最多。（三）MAPK中的JNK,ERK参与CCR5的表达上调Aβ能够使HBMECs上的p-JNK和p-ERK表达增加,SP600125（JNK抑制剂）和U0126（ERK抑制剂）能够抑制Aβ上调的CCR5表达。（四）PI3K/AKT通路参与CCR5的表达上调Aβ能够使HBMECs上p-AKT表达增加,LY294002（PI3K的抑制剂）能够抑制Aβ上调的p-AKT表达。（五）Aβ能够上调HBMECs上Egr-1的表达。（六）Egr-1是Aβ上调CCR5表达的关键的转录因子Aβ能够增强Egr-1与CCR5启动子的结合,SP600125（JNK抑制剂）,LY294002（PI3K的抑制剂）和PD98059（MEK抑制剂）能够抑制Aβ增强的Egr-1与CCR5启动子的结合。（七）HBMECs上的Egr-1被干扰后,Aβ不再上调CCR5的表达,但MAPK和AKT信号分子的活化不受影响。二、Aβ通过RAGE受体上调HBMECs表面CCR5表达（一）Aβ能够诱导RAGE的mRNA表达。（二）Aβ能够诱导HBMECs上的RAGE蛋白表达1.25nM-125nM的AB作用于HBMECs两个小时后能够诱导RAGE蛋白表达;Aβ作用30分钟RAGE蛋白表达开始增加。（三）RAGE中和抗体能够抑制Aβ上调的CCR5表达。（四）RAGE中和抗体能够抑制Aβ上调的p-JNK、P-ERK和P-AKT的表达。（五）获得过表达RAGE的稳定转染的HBMECs(即HBMECRAGE+),使用RAGE抗体进行鉴定;获得RAGE胞内段缺失的HBMECs(即HBMECC-truncatedRAGE)和RAGE胞外段缺失的HBMECs(即HBMECN-truncated RAGE),使用His抗体进行鉴定。（六）RAGE的过表达能够促进Aβ上调CCR5表达:当加入Aβ后,HBMECRACE+的CCR5表达比HBMECs更早到达高峰。（七）Aβ不能上调HBMECC-truncated RAGE和HBMECN-truncated RAGE上CCR5的表达,也不能增加p-JNK、p-ERK和p-AKT的表达。三、Aβ上调的CCR5表达促进T淋巴细胞入脑（一）6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMEC单层对Aβ有浓度依赖性。（二）6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMECCCR5+单层的数量明显多于穿过HBMECCCR5-单层的数量。（三）Aβ不能增加6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMECCCR5-单层的数量。（四）RAGE中和抗体能够减少Aβ引起的6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMEC单层的数量。（五）Aβ不能增加6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过HBMECC-truncated RAGE单层和HBMECN-truncated RAGE单层的数量。（六）YNK siRNAs和ERK siRNAs瞬时转染到HBMECs后,Aβ不再上调CCR5的表达,而且不能增加6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过的数目。（七）在PI3K△P110的HBMECs,Aβ不再上调CCR5的表达,而且Aβ不能增加6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过的数量。（八）Aβ不能增加6T-CEM细胞和AD病人外周血T淋巴细胞穿过Egr-1干扰后的HBMECs单层的数量。结论Aβ通过与HBMECs表面的RAGE受体相互作用,活化MAPK和PI3K/AKT信号分子,增强Egr-1与CCR5启动子的结合,上调HBMECs上的CCR5表达,促进T淋巴细胞穿过HBMEC单层。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一、Aβ通过MAPK/PI3K-Egr-1上调人脑微血管内皮细胞CCR5表达
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果（附论文图表）
• 讨论
• 结论
• 论文二、Aβ通过RAGE受体上调人脑微血管内皮细胞CCR5的表达
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果（附论文图表）
• 讨论
• 结论
• 论文三、T淋巴细胞穿过人脑微血管内皮细胞与Aβ上调人脑微血管内皮细胞CCR5表达相关
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果（附论文图表）
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介