论文摘要
DNA大分子上的一种特异硫修饰最初发现于革兰氏阳性细菌变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）。DNA分子上除了碳、氢、氧、氮和磷以外,还存在第六种元素-硫。该修饰被确定为DNA的磷酸二酯键发生了磷硫酰化,硫原子取代了羟基上的氧原子成为RP构象的硫代磷酸二酯键。这是除了核酸碱基上的修饰以外,首次发现在DNA骨架上存在的修饰。DNA磷硫酰化的研究始于从野生型变铅青链霉菌中提取的染色体DNA在高压脉冲电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）和普通凝胶电泳时发生了可被硫脲抑制的降解（DNA degradation, Dnd）。研究证明,修饰的DNA在体外氧化条件下被Tris过酸衍生物攻击而产生双链切割反应,因此在电泳过程中产生6-10 kb的片段。目前与修饰/降解有关的基因簇（dnd cluster）已被定位和测序,内含五个基因,分别命名为dndA、dndB、dndC、dndD和dndE。在与大肠杆菌亲缘关系非常近的革兰氏阴性细菌肠道沙门氏菌中也存在着大量可被硫脲抑制的PFGE分型时发生降解现象的菌株。本研究致力于系统分析变铅青链霉菌上的dnd基因功能,并在沙门氏菌中深入探索DNA磷硫酰化修饰现象,探索其生物学意义。变铅青链霉菌dnd基因簇的核心区域被浓缩到只含五个ORF（dndA-E）的6665 bp大小的DNA片段上,与左侧dndA终止密码子的距离为4 bp,与右侧dndE终止密码子的距离为472 bp。整合含有各单基因缺失的dnd基因簇到HXY6（完整dnd基因簇缺失突变株）的染色体上,得到工程菌株XTG1-5,分析了它们的Dnd表型。dndA, C, D, E的同框缺失导致了Dnd表型的丧失,dndB的同框缺失却加重了Dnd表型。相应基因的表达质粒回补到这些工程菌株中能够恢复原来的Dnd表型,说明dndA, C, D, E是DNA磷硫酰化修饰所必需的,而dndB可能起到调控的作用。通过诱导表达这些蛋白来研究它们对生物体的影响,与DndA,DndB,DndE不同,过量的DndC和DndD会造成菌株完全停止生长,说明整个dnd基因簇是通过五个蛋白严格控制、协调作用来完成DNA磷硫酰化修饰功能的。深入研究Salmonella enterica serovar Cerro 87中的DNA磷硫酰化现象。发现它同样具有Dnd表型并且DNA降解程度高于变铅青链霉菌,说明Salmonella enterica serovar Cerro 87中的DNA发生了高度的DNA磷硫酰化修饰。通过dnd同源基因保守区域设计简并引物克隆赋予Salmonella enterica serovar Cerro 87中Dnd表型的sed基因簇,该基因簇与变铅青链霉菌的dnd基因簇不同,它不含有变铅青链霉菌中参与DNA硫修饰所必须的dndA的同源基因,而只含有dndB-E的同源基因SedB-E。携带这个基因簇的质粒pJTU1238可以在E. coli DH5α中成功地磷硫酰化宿主及其自身的DNA,并最终导致DNA硫修饰结构的确定。DNA磷硫酰化与一种特殊的限制系统相关,从野生型菌株Salmonella enterica serovar Cerro 87或者大肠杆菌DNA磷硫酰化工程菌株中分离出来的经磷硫酰化修饰的质粒能够容易的转化进入Salmonella enterica serovar Cerro 87中,而从突变菌株XTG102或者是大肠杆菌中分离出来的没有被磷硫酰化修饰的质粒的相对转化效率却要低一到两个数量级。缺失掉这个基因簇,突变菌株XTG102的限制表型也相应的丢失了。回补携带sed基因簇的质粒pJTU1238到突变菌珠XTG102后,该突变菌珠又恢复了宿主的限制表型,充分证明sed基因簇除控制DNA磷硫酰化修饰以外还参与了相关的限制功能。通过构建基因组文库,定位了一个与sed基因簇紧密连锁的含有四个ORF（sedF-I）的基因簇,通过基因缺失确定了sedF、sedG、sedH三个基因参与了限制功能,而sedI的缺失不影响宿主的限制功能。进一步对基因库中DNA磷硫酰化修饰-限制同源基因簇进行了分析,并通过实验验证了E.coli B7A中也存在DNA磷硫酰化修饰-限制系统。说明这种磷硫酰化修饰限制现象在生物界中是广泛存在的。