基于大规模PCR生产线性DNA及重组酶介导的线性DNA环化研究

论文摘要

定位重组是由单个多肽酶(重组酶)识别特定的DNA序列(特异性识别位点),并根据特异位点的相对方向对特异识别位点之间的DNA的进行交换、重组、删除与逆转的一种重组系统,整个反应过程可在体外进行且不需要额外能量和辅助因子的参与。本研究拟在该课题前期已建立的通过大规模PCR技术廉价、高效地获得大量线性DNA产物的方法的基础上,利用该系统建立一种新的体外获得环状DNA的方法,即将线性DNA通过定位重组系统转化为环状DNA,为实现高通量离体生产环状DNA提供理论依据。实验结果证实,利用前期已在酵母中表达的DNA聚合酶,我们成功地建立了50ml的PCR体系,通过该方法获得的PCR产物的浓度与常规的方法获得DNA浓度相当；同时将Cre重组酶在大肠杆菌表达系统中成功达,并初步证明纯化后的Cre重组酶具有在体外环化线性DNA的功能。这些结果为进一步实现更大规模的体外生产环状DNA方式奠定了坚实的基础。与传统的通过质粒抽提获得DNA的方法相比,利用大规模PCR和重组酶法获得的环状DNA具备无细菌内毒素和抗生素的污染、成本低、制备周期短等优点,且易删除与表达无关的DNA元件,因此该方法可为无细胞体系快速制备环状DNA开辟了一种新的途径。随后的研究中,我们拟通过大规模PCR的方法制备DNA疫苗,即利用大规模PCR技术获得大量编码某种抗原蛋白的外源基因的“盒式”表达结构产物,经简单纯化后作为线性DNA疫苗直接免疫机体。初步试验结果表明通过本方法获得的线性DNA疫苗具有一定的保护效果,但是与预期的目标还有一定的差距。鉴于环状DNA的稳定性优于线性DNA的,因此拟进一步将线性DNA经重组酶处理后形成环状DNA后作为疫苗免疫机体,检测能否获得更好的保护效果。总之,本研究为快速、大规模制备DNA疫苗迅速应对新发传染病提供了一种新的策略。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1 位点特异性重组酶的概述
• 1.1.1 常用定位重组系统
• 1.1.2 常用定位重组酶的作用方式
• 1.1.3 定位重组系统的应用
• 1.2 PCR技术的定义及发展简史
• 1.2.1 PCR技术的应用
• 1.2.2 大规模PCR的现状
• 1.3 DNA疫苗
• 1.3.1 DNA疫苗的研究历史
• 1.3.2 DNA疫苗的优点和缺点
• 1.3.3 质粒DNA疫苗
• 1.3.4 线性DNA疫苗
• 1.3.5 DNA疫苗的免疫途径
• 1.3.6 DNA疫苗的前景
• 1.4 本文的研究目标与意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和酶
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.1.5 主要缓冲液
• 2.1.6 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA的小量抽提
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.4 大肠杆菌的快速转化
• 2.2.5 外源基因在大肠杆菌中的诱导与表达
• 2.2.6 His融合蛋白的纯化
• 2.2.7 PCR产物的T4 DNA聚合酶处理
• 2.2.8 SDS-PAGE检测目的蛋白
• 2.2.9 毕赤酵母感受态细胞制备
• 2.2.10 毕赤酵母的电击转化
• 2.2.11 外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达
• 2.2.12 酵母总DNA的提取
• 2.2.13 PCR产物的无水乙醇沉淀
• 2.2.14 线性DNA的体外环化
• 2.2.15 晡乳动物细胞系Hda的传代培养
• 2.2.16 哺乳动物细胞的转染
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 Cre重组酶基因的合成及表达载体的构建
• 3.1.1 Cre酶基因的合成
• 3.1.2 Cre酶大肠杆菌重组表达载体的构建
• 3.1.3 Cre酶毕赤酵母重组表达载体的构建
• 3.2 FLP重组酶基因的获得及重组表达载体的构建
• 3.2.1 FLP重组酶基因的获得
• 3.2.2 FLP重组酶原核表达载体的构建
• 3.3 Cre酶和FLP酶反应底物质粒的构建
• 3.4 毕赤酵母的电击转化及重组菌株的鉴定
• 3.5 重组酶Cre、Flp的诱导表达及SDS-PAGE分析
• 3.6 大规模PCR技术的探索
• 3.7 大规模PCR产物功能的验证
• 3.7.1 细胞水平的验证
• 3.7.2 动物体内功能的验证
• 3.8 线性DNA的体外环化
• 3.8.1 以plox2和ha-loxp为底物的环化
• 3.8.2 以质粒Loxp-amp-PGMG为底物的环化反应
• 第四部分 讨论
• 4.1 大规模PCR技术
• 4.2 位点特异性重组酶的表达与线性DNA的体外环化
• 4.3 DNA疫苗
• 参考文献
• 致谢