蜡蚧轮枝菌“Lecanicillium lecanii（Zimmerman）Viegas”苯菌灵抗性基因转化的研究

论文摘要

蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）是一种重要的虫生真菌,寄主范围广,对蚜虫、粉虱、蚧、蓟马、害螨等农业害虫均具有良好的寄生效果,是一种优良的生防真菌。但蜡蚧轮枝菌对常用的杀菌剂敏感,在病虫害综合防治中与杀菌剂不易兼容使用,影响真菌杀虫剂的效果发挥。本研究针对这一问题,筛选苯菌灵抗性菌株,克隆苯菌灵抗性基因,将其导入蜡蚧轮枝菌,使蜡蚧轮枝菌具有较高的抗药性,协调生物防治与化学防治。本研究主要结果如下:1.筛选得到抗药性强的菌株:从长期使用苯并咪唑类杀菌剂的农田中采集植物病原菌,从北京农产品市场采集贮藏期植物病原菌,同时收集一些其他研究单位收藏的菌株,分离纯化鉴定为3属5种（35个菌株）,利用菌落直径法对各菌株的苯菌灵敏感性进行了测定,筛选出一批敏感菌株,EC50为0.0158-0.0384μg/mL,筛选出2个高抗性的菌株,EC50最高达到936.2670μg/mL。2.克隆得到具有高抗苯菌灵的基因:以筛选出的灰葡萄孢霉SD2菌株为出发材料,以灰葡萄孢霉BenA基因序列为基础设计引物,以cDNA为模板同源克隆到苯菌灵抗性基因BenA,克隆得到的基因与Genebank登录的BenA基因的同源性为99%,其编码的第198位氨基酸为缬氨酸（Val）,证明克隆得到的基因具有抗苯菌灵的特性。3.构建BenA基因表达载体:以pBHt2质粒为基础,扩增真菌启动子TrpC,通过套叠PCR方式将TrpC、BenA连接,用T4 DNA连接酶将“TrpC-BenA”片段与载体PGM-T线性片段连接,形成pGM-TB载体;用T4 DNA连接酶将双酶切（SacⅠ和HindⅢ）载体pGM-TB所产生的小片段与双酶切载体pBHt2所产生的大片段连接起来,形成pBHt2-TB载体,将pBHt2-TB载体导入农杆菌AGL-l中。4.建立了农杆菌介导的蜡蚧轮枝菌转化系统:采用农杆菌介导法,通过表达载体pBHt2-TB将苯菌灵抗性基因导入到蜡蚧轮枝菌CA14菌株中,以潮霉素B为标记筛选转化子。对转化系统参数进行了优化,优化结果:诱导培养基AS的浓度为200μM,诱导培养时间为4-6 h,农杆菌终浓度OD600值为0.6,共培养基AS的浓度为200μM,共培养时间为36-48 h,共培养温度在24-28℃,蜡蚧轮枝菌孢子浓度为106个孢子/mL。系统转化效率为24个转化子/106个孢子。5.得到具有较高抗性的转化子:从大量的转化子中随机挑选47株假定转化子进行检测,根据启动子和抗性基因连接处的序列设计引物,采用PCR检测,结果显示,有3个假定转化子未检测到目的片段,假阳性为6.38%;遗传稳定性分析,将44株转化子在不含潮霉素B的PDA平板上继代培养5代,其中有9.09%的转化子其潮霉素B抗性在传代过程中丢失。转录分析,对能在5μg/mL苯菌灵PDA上生长的转化子经RT-PCR分析,均能正常转录。抗性分析,用菌落直径法测定转化子的苯菌灵抗性,结果表明,其抗性比出发菌株最大提高了170倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 蜡蚧轮枝菌的研究概况
• 1.2 农杆菌介导的真菌遗传转化
• 1.2.1 概况
• 1.2.2 农杆菌载体系统分类
• 1.2.3 农杆菌转化特点
• 1.2.4 影响农杆菌转化的因素
• 1.3 真菌的其它转化方法
• 1.3.1 PEG 介导的转化系统
• 1.3.2 电击转化系统
• 1.3.3 基因枪法转化系统
• 1.3.4 限制性内切酶介导的转化系统
• 1.4 真菌苯菌灵抗性研究进展
• 1.5 本研究目的意义
• 1.6 研究内容与技术路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 第二章 苯菌灵抗性菌株筛选及其抗性基因克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 菌株采集
• 2.1.3 菌株分离与纯化
• 2.1.4 菌株形态鉴定
• 2.1.5 菌株分子鉴定
• 2.1.6 菌株敏感性测定
• 2.1.7 苯菌灵抗性基因扩增
• 2.1.8 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌株鉴定
• 2.2.2 菌株的敏感性测定
• 2.2.3 菌株的总RNA 提取
• 2.2.4 苯菌灵抗性基因电泳分析
• 2.2.5 苯菌灵抗性基因序列分析
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 农杆菌表达载体构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与仪器
• 3.1.2 载体构建技术路线
• 3.1.3 真菌启动子TrpC 的扩增
• 3.1.4 TrpC-BenA 连接片段TB 扩增
• 3.1.5 TB 片段与PGM-T 质粒连接
• 3.1.6 TB 片段与pBHt2 质粒连接
• 3.1.7 农杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.8 pBHt2 质粒转化感受态细胞
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 真菌启动子TrpC 扩增
• 3.2.2 TB 片段的扩增
• 3.2.3 TB 片段与PGM-T 质粒连接
• 3.2.4 质粒双酶切
• 3.2.5 TB 片段与pBHt2 质粒连接
• 3.2.6 农杆菌转化子PCR 验证
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 农杆菌介导的蜡蚧轮枝菌转化及其体系优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与仪器
• 4.1.2 菌株鉴定
• 4.1.3 抑制蜡蚧轮枝菌孢子萌发的潮霉素B 浓度选择
• 4.1.4 抑制蜡蚧轮枝菌菌丝生长的潮霉素B 浓度选择
• 4.1.5 抑制农杆菌生长的头孢霉素浓度选择
• 4.1.6 农杆菌介导的蜡蚧轮枝菌转化
• 4.1.7 转化体系的优化
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菌种鉴定
• 4.2.2 抑制蜡蚧轮枝菌孢子萌发的潮霉素B 浓度
• 4.2.3 抑制蜡蚧轮枝菌菌丝生长的潮霉素B 浓度
• 4.2.4 抑制农杆菌生长的头孢霉素浓度
• 4.2.5 转化体系的优化
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 转化子验证
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与仪器
• 5.1.2 假定转化子单孢分离
• 5.1.3 假定转化子PCR 验证
• 5.1.4 转化子遗传稳定性分析
• 5.1.5 转化子RT-PCR 验证
• 5.1.6 转化子对苯菌灵敏感性测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转化子形态观察
• 5.2.2 假定转化子PCR 检测
• 5.2.3 转化子遗传稳定性
• 5.2.4 转化子RT-PCR 检测
• 5.2.5 转化子苯菌灵抗性检测
• 5.3 结论与讨论
• 第六章 结论与讨论
• 6.1 全文结论
• 6.2 讨论
• 6.3 本研究创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历