麦角固醇抑制剂酮康唑对三孢布拉氏霉菌异戊二烯合成途径代谢调控的研究

论文摘要

三孢布拉氏霉菌是目前国内外用于发酵生产β-胡萝卜素和番茄红素的工业菌株。由于β-胡萝卜素和番茄红素具有抗氧化,消除人体自由基、防癌、抗癌、防止心血管疾病等优越的生理功能,近年来受到广泛关注。采用微生物法发酵生产又是国内外研究的热点之一。许多研究表明,一些促进剂的添加可以大大提高三孢布拉霉菌次级代谢产物的产量,但是其中的代谢调控机理并不十分清楚。本论文主要研究添加酮康唑（一种麦角固醇抑制剂）对于三孢布拉氏霉菌发酵水平和转录水平的影响,并建立了能够有效分离三孢布拉氏霉菌全蛋白的双向电泳条件,为后续开展三孢布拉霉菌蛋白质组学的研究奠定了基础。主要研究内容和结果如下:（1）考察了麦角固醇抑制剂酮康唑的添加对于三孢布拉霉菌次级代谢产物合成的影响。实验结果表明,培养30h的菌体中添加浓度为30mg/L的酮康唑,在发酵后期72h,菌体中β-胡萝卜素和辅酶Q9的含量对比空白样分别提高了140%和243%。另外,添加酮康唑的菌体中麦角固醇的含量比对照样减少了33%。（2）考察了酮康唑的添加对于该代谢途径上的两个关键基因hmgR和carRA的转录水平的影响。结果表明,30mg/L的酮康唑能够最大程度地促进hmgR和carRA基因的转录。在添加后的6h,hmgR和carRA基因的mRNA含量开始增加,并且一直持续到24h达到最大值,分别为3倍和3.5倍。（3）研究三孢布拉霉菌全蛋白的提取方法,包括细胞破碎、提取液选择,以及双向电泳条件的优化。实验结果表明,利用植物蛋白提取试剂盒抽提液氮研磨的菌体粉末,可以有效的溶解一些疏水蛋白。沉淀重溶使用的再水化液,其中的离液剂引入硫脲虽然能够提高蛋白的溶解度,但是造成了双向电泳图谱上酸性末端严重的横条纹,使用含有8M尿素的再水化液得到的双向电泳图谱质量较好。IPG胶条选择在PH5-8的范围可以保证三孢布拉霉菌全蛋白图谱的完整性和清晰度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 Blakeslea trispora代谢途径
• 1.2 类胡萝卜素的理化性质
• 1.3 类胡萝卜素的生理功能
• 1.4 辅酶Q的理化性质与生理功能
• 1.5 Blakeslea trispora发酵水平的研究
• 1.5.1 发酵培养条件
• 1.5.2 类胡萝卜素合成促进剂
• 1.5.3 番茄红素环化酶阻断剂
• 1.6 Blakeslea trispora关键基因及其代谢调控的研究
• 1.7 荧光定量PCR技术
• 1.8 蛋白质组分析技术
• 1.8.1 蛋白质组学的研究内容
• 1.8.1.1 蛋白质鉴定
• 1.8.1.2 翻译后修饰
• 1.8.1.3 蛋白质功能确定
• 1.8.1.4 分子医学
• 1.8.2 蛋白质组研究中的样品制备
• 1.8.3 蛋白质组研究中的蛋白质的分离、分析
• 1.8.4 蛋白质组生物信息学
• 1.9 本课题研究目的和意义
• 第二章 酮康唑对Blakeslea trispora代谢产物合成的影响
• 2.1 酮康唑的介绍
• 2.1.1 酮康唑的结构与理化性质
• 2.1.2 酮康唑的作用机理与应用
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.5.1 培养条件
• 2.2.5.2 菌体干重的测定
• 2.2.5.3 β-胡萝卜素含量的测定
• 2.2.5.4 麦角固醇的提取与检测
• 9的提取与测定'>2.2.5.5 辅酶Q₉的提取与测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酮康唑的添加浓度对代谢产物合成的影响
• 2.3.2 最适浓度酮康唑的添加对菌体合成麦角固醇的影响
• 2.3.3 最适浓度酮康唑的添加对菌体合成β-胡萝卜素和辅酶Q9的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 酮康唑对Blakeslea trispora关键基因转录水平的影响
• 3.1 实验背景介绍
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.2.5.1 菌种培养条件
• 3.2.5.2 RNA提取所需试剂与材料
• 3.2.5.3 总RNA的提取与检测
• 3.2.5.4 总RNA的反转录
• 3.2.5.5 tef1基因转录水平测定
• 3.2.5.6 荧光定量PCR引物设计
• 3.2.5.7 荧光定量PCR
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 总RNA的提取与反转录
• 3.3.2 选择tef1作为内参基因的有效性
• 3.3.3 酮康唑的添加浓度对hmgR和carRA基因转录水平的影响
• 3.3.4 最适浓度酮康唑的添加对hmgR和carRA基因转录水平的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 用于二维电泳的Blakeslea trispora总蛋白制备方法研究
• 4.1 实验背景介绍
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 实验方法
• 4.2.5.1 菌种培养条件
• 4.2.5.2 样品的制备
• 4.2.5.3 蛋白定量
• 4.2.5.4 双向电泳
• 4.2.5.5 银染
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 用于双向电泳的总蛋白制备方法的建立
• 4.3.1.1 不同细胞破碎方法对蛋白提取的影响
• 4.3.1.2 不同提取液对蛋白提取的影响
• 4.3.2 双向电泳优化条件
• 4.3.2.1 不同IPG胶条的影响
• 4.3.2.2 不同上样缓冲液对双向电泳结果的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 附录一 实验药品
• 附录二 实验主要设备
• 致谢
• 在读期间发表论文
• 作者与指导教师简介
• 北京化工大学硕士研究生学位论文答辩委员会决议书