食品中苏丹红Ⅰ的免疫学快速检测方法研究

论文摘要

本研究通过制备苏丹红I多克隆抗体，建立了两种用于快速测定食品中苏丹红I的免疫学检测方法—竞争酶联免疫吸附法（ELIS A）和胶体金免疫层析试纸条法。本文利用重氮法合成苏丹红I衍生物，再用混合酸酐法将苏丹红I衍生物和明胶偶联，形成的苏丹红I衍生物-明胶复合物作为免疫抗原。按照常规免疫程序免疫新西兰白兔制备抗苏丹红I多克隆抗体。免疫程序结束后采用颈动脉取血法获得抗血清，抗血清经辛酸硫酸铵法和亲和层析法纯化后，可以得到特异性的抗苏丹红I抗体。通过优化ELIS A操作中的各种条件，来测定特异性抗体的效价和亲和力，并建立食品中苏丹红I竞争ELISA的检测方法。利用酶标记的苏丹红I抗原和待测样品中可能存在的苏丹红I竞争性的与固相载体上的苏丹红I抗体结合，待测样品中苏丹红I含量多，则形成的非酶标记复合物多，酶标苏丹红I抗原与抗体则结合少，即显色程度与待测样品中的苏丹红I含量成反比。通过绘制线性回归标准曲线，计算样品中苏丹红I的浓度。结果表明苏丹红I抗体的效价为1: 32 000。抑制率曲线得到竞争ELIS A最低检测限为1.0μg /L，IC 50为15.0μg/L，表明抗体具有较高的亲和力。加标回收率为85.8 8 %-97. 83 %，变异系数为4.9%-7 .4 %。该方法对苏丹红II、III、IV的交叉反应率分别为2.7%、6.5%和4.1%。胶体金免疫层析试纸条的制备，是以硝酸纤维素膜（NC膜）作为载体，将抗苏丹红I抗体和抗BSA抗体包被在NC膜上，分别作为检测线（T）和质控线（C）。用胶体金标记的苏丹红I抗原喷涂在金标垫上，最佳工作条件确定后，组装试纸条。在层析作用下，待测样品中可能存在的苏丹红I与金标苏丹红I竞争结合NC膜上的抗体。待测液中的苏丹红I含量越多，与金标抗原的竞争作用越明显。检测线T的显色程度与待测样品中的苏丹红I含量成反比。通过对NC膜上两种包被抗体的浓度和金标垫上金标抗原含量的优化，确定试纸条的最低检测限和灵敏度。结果表明，本方法对辣椒粉中的苏丹红I最低检测限为10μg/ kg。在苏丹红I浓度为5.0 -20 .0μg /kg范围内可实现定量分析。变异系数≤9.23 %。对其他苏丹红染料有低的交叉反应性。与HPLC方法相比，相关系数R2 =0.9 41，测定结果相一致。本方法高效、简便且耗时短，适用于食品中苏丹红I残留的快速检测及大量苏丹红I待检样品的筛查测定。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第1章 绪论
• 1.1 食品中苏丹红检测方法的研究进展
• 1.1.1 苏丹红染料的性质及危害
• 1.1.2 食品中苏丹红的检测方法
• 1.2 免疫学检测技术及其应用
• 1.2.1 免疫胶体金技术
• 1.2.2 酶联免疫技术
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第2章 苏丹红I 多克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.2 苏丹红I 多克隆抗体的制备
• 2.2.1 苏丹红I 衍生物- 明胶全抗原的合成
• 2.2.2 抗苏丹红I 多克隆抗体的制备
• 2.3 苏丹红I 多克隆抗体的纯化
• 2.3.1 辛酸硫酸铵法粗纯化苏丹红I 多克隆抗体
• 2.3.2 亲和层析法纯化苏丹红I 多克隆抗体
• 2.4 SDS- PAGE 测定IgG 纯度
• 2.4.1 样品的制备
• 2.4.2 分离胶及浓缩胶的制备
• 2. 5 抗苏丹红I抗体浓度的测定
• 2.5.1 BCA 法测定蛋白质浓度
• 2.5.2 紫外分光光度计法测定IgG 浓度
• 2.6 结果与讨论
• 2.6.1 苏丹红I 衍生物及完全抗原的制备
• 2.6.2 苏丹红I- 明胶完全抗原的合成结果
• 2.6.3 苏丹红I- 明胶抗体亲和层析纯化
• 2.6.4 SDS- PAGE 测定IgG 的纯度
• 2.6.5 抗体浓度的测定
• 2.7 讨论
• 第3章 苏丹红I 竞争ELISA 检测方法的建立
• 3.1 抗苏丹红I 抗体效价的测定
• 3.1.1 包被抗原最佳浓度的选择
• 3.1.2 最佳封闭液的选择
• 3.1.3 抗原、抗体最佳作用时间的选择
• 3.1.4 最佳底物反应时间的选择
• 3.1.5 特异性抗体效价测定
• 3.2 抗苏丹红I 抗体亲和力的测定
• 3.3 苏丹红染料交叉反应率的测定
• 3.4 间接竞争ELIS A 检测方法的建立
• 3.4.1 酶标记苏丹红I 抗原的制备
• 3.4.2 间接竞争ELIS A 标准曲线的绘制
• 3.4.3 待测样品的处理及加标回收率测定
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 ELIS A 法测定抗体效价
• 3.5.2 抗苏丹红I 特异性抗体亲和力的测定
• 3.5.3 苏丹红I 抗体的交叉反应率测定
• 3.5.4 苏丹红ELISA检测方法的建立
• 3.6 讨论
• 3.6.1 固相载体的选择
• 3.6.2 包被和封闭操作要点
• 3.6.3 洗涤
• 3.6.4 待测样品的处理
• 3.6.5 酶、酶结合物及底物对ELIS A 的影响
• 第4章 胶体金免疫层析试纸的制备及检测
• 4.1 主要材料与仪器
• 4.2 胶体金溶液的制备
• 4.2.1 玻璃器皿的清洗
• 4.2.2 胶体金溶液的制备
• 4.2.3 胶体金质量的鉴定
• 4.3 苏丹红I –BSA 金标抗原的制备
• 4.3.1 胶体金溶液和待标记抗原的准备
• 4.3.2 最佳标记抗体用量的选择
• 4.3.3 胶体金标记苏丹红I-BSA抗原
• 4.3.4 胶体金蛋白结合物的质量鉴定
• 4.4 免疫金试纸条的制备
• 4.4.1 硝酸纤维素膜的选择
• 4.4.2 NC 膜上包被抗体的浓度选择
• 4.4.3 金标抗原用量的选择
• 4.4.4 试纸条的组装
• 4.5 免疫层析试纸的测试
• 4.6 试纸条稳定性及重复性试验
• 4.7 试纸条交叉反应试验
• 4.8 ELIS A 、免疫层析试纸、HPLC 三种方法的比较
• 4.9 结果与分析
• 4.9.1 稳定胶体金最适抗原标记量的选择
• 4.9.2 硝酸纤维素膜的选择
• 4.9.3 NC 膜上T、C 抗体浓度的选择
• 4.9.4 金标抗原用量的选择
• 4.9.5 试纸条测试与分析
• 4.9.6 稳定性与重复性实验
• 4.9.7 试纸条交叉反应试验
• 4.9.8 ELIS A 、试纸条与HPLC 测定结果比较
• 4.9.9 实际样品测定
• 4.10 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果