嗜铁钩端螺旋菌抗砷基因簇的生物信息学分析及改造

论文摘要

近几十年来,我国矿场资源的消耗速度不断加快,而且通过常规的物理、化学开采法所带来的环境污染非常严重,与当今社会可持续发展的要求背道而驰。在这样的情况下,微生物在生物冶金方面所起的作用越来越受到人们的重视。嗜铁钩端螺旋菌（Leptospirillum ferriphilum,简称L. ferriphilum）,是一类嗜酸性专性自养铁氧化细菌,螺旋状,革兰氏阴性菌,有鞭毛,可以运动,最适生长pH 2.0,最适生长温度40℃,可以耐受较低的pH值以及较高的氧化还原电位和温度,因此是生物浸矿的优势种群,在微生物采矿中发挥着重要的作用。但在实际的应用过程中,该菌生长缓慢、细胞得率低以及对砷、汞、银等重金属缺乏抗性。不仅限制了其应用范围,而且也给实验室的研究工作带来许多不便,严重阻碍了生物浸矿的发展,对嗜铁钩端螺旋菌进行遗传改造就成为了一个行之有效的方法,那么对基因组进行序列分析,找出与重金属抗性尤其是砷抗性相关的基因,阐明基因的表达调控机制则是首要解决的问题。本实验室对L. ferriphilum进行了全基因组测序,采用生物信息学的方法对基因组进行功能注释,分析了基因和基因产物之间的相互关系,发现L. ferriphilum包含一大一小两个抗砷基因簇。本次的研究重点主要是含有功能基因arsA、arsB、arsC和调节基因arsR和arsD,以及一个磷酸转移系统的大的抗砷基因簇,并且对不同细菌所含的抗砷基因进行了序列相似性分析。本实验将来自于大肠杆菌Plasmid R773和L. ferriphilum中的抗砷基因与实验室所构建的载体pSDU1和敲除了与结合转移相关的mob位点的载体pSDU1-remob进行连接,以氯霉素基因为报告基因,成功构建了组成型及可调控型的抗砷质粒pSDU1-tac-Ars 1、pSDU1-remob-tac-Ars1、pSDU1-tac-Ars2和pSDU1-ArsⅠ-S。将这些抗砷质粒转入大肠杆菌中,并对其在大肠杆菌中的抗砷性能进行了检测,结果表明,新型的高拷贝质粒pSDU1-remob-tac-Ars1具有较高的抗砷能力,其对砷的最大抑制浓度能达到20mmol／L,此外抗砷基因在tac启动子的带动下能获得高效的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩略语
• 第一章 绪论
• 1.1 生物冶金
• 1.1.1 生物冶金技术概述
• 1.1.2 生物冶金中的浸矿微生物
• 1.1.3 浸矿机理
• 1.2 细菌抗砷机制研究
• 1.2.1 原核生物抗砷基因及抗砷机制
• 1.2.1.1 抗砷基因
• 1.2.1.2 抗砷机制
• 1.2.2 真核生物抗砷基因及抗砷机制
• 1.3 脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE）
• 1.3.1 PFGE原理
• 1.3.2 PFGE的种类
• 1.3.3 PFGE的影响因素
• 1.3.4 PFGE的应用
• 1.3.4.1 PFGE在分子分型方面的作用
• 1.3.4.2 PFGE在DNA辐射损伤和修复研究中的应用
• 1.3.4.3 PFGE在细胞凋亡研究中的应用
• 1.3.4.4 PFGE在转基因方面的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 嗜铁钩端螺旋菌基因组DNA脉冲场凝胶电泳分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要缓冲液
• 2.1.3 培养基和培养条件
• 2.1.4 L. ferriphilum基因组DNA脉冲场凝胶电泳
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 L. ferriphilum基因组DNA PFGE条件优化与分析
• 2.2.1.1 L. ferriphilum基因组DNA PFGE条件优化
• 2.2.1.2 L. ferriphilum基因组DNA PFGE分析
• 2.2.2 L.ferriphilum基因组提取方法优化
• 第三章 嗜铁钩端螺旋菌ML-04抗砷基因序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 嗜铁钩端螺旋菌抗砷基因簇图解
• 3.2.1.1 L. ferriphilum ML-04大的抗砷基因簇图解
• 3.2.1.2 L. ferriphilum ML-04小的抗砷基因簇图解
• 3.2.2 L. ferriphilum ML-04抗砷基因序列同源性分析
• 3.2.2.1 抗砷基因arsA（LF-2406）序列同源性分析
• 3.2.2.2 抗砷基因arsB（LF-2404）序列同源性分析
• 3.2.2.3 抗砷基因arsC（LF-2408）序列同源性分析
• 3.2.2.4 抗砷基因arsD（LF-2407）序列同源性分析
• 3.2.2.5 抗砷基因arsR（LF-2409）序列同源性分析
• 3.2.3 嗜铁钩端螺旋菌抗砷基因序列差异性分析
• 3.2.3.1 抗砷基因arsA（LF-2406）序列差异性分析
• 3.2.3.2 抗砷基因arsB（LF-2404）序列差异性分析
• 3.2.3.3 抗砷基因arsC（LF-2408）序列差异性分析
• 第四章 嗜铁钩端螺旋菌抗砷基因簇的改造
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 主要试剂和仪器
• 4.1.3 培养基和培养条件
• 4.1.3.1 大肠杆菌培养基
• 4.1.3.2 嗜铁钩端螺旋菌培养基
• 4.1.4 抗生素使用浓度
• 4.1.5 基因组DNA的提取与定量
• 4.1.6 质粒DNA的提取
• 4.1.6.1 质粒DNA的快速提取
• 4.1.6.2 质粒DNA的试剂盒提取
• 4.1.7 DNA片段纯化
• 4.1.8 抗砷质粒的构建
• 4.1.8.1 L. ferriphilum调节型抗砷基因簇的扩增及抗砷质的粒pSDU1-Ars Ⅰ-S （L. ferriphilum）构建
• 4.1.8.2 L. ferriphilum调节型抗砷基因簇的改造及抗砷质粒pSDU1-tac-Ars2 （L. ferriphilum）的构建
• 4.1.8.3 E. coli Plasmid R773中抗砷基因簇的扩增及抗砷质粒pSDU1-tac-Ars1 （Plasmid R773）的构建
• 4.1.8.4 新型高拷贝抗砷质粒pSDU1-remob-tac-Ars1 （Plasmid R773）的构建
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 抗砷质粒pSDU1-Ars Ⅰ-S （L. ferriphilum）的构建
• 4.2.1.1 pSDU1载体片段的克隆
• 4.2.1.2 不含磷酸转移系统的抗砷基因簇Ars Ⅰ-S的克隆
• 4.2.1.3 抗砷质粒pSDU1-Ars Ⅰ-S构建
• 4.2.2 抗砷质粒pSDU1-tac-Ars2 （L. ferriphilum）的构建
• 4.2.2.1 载体pSDU1-tac的克隆
• 4.2.2.2 抗砷基因arsA的克隆
• 4.2.2.3 质粒载体pSDU1-tac-arsA酶切验证
• 4.2.2.4 抗砷基因arsB的克隆
• 4.2.2.5 质粒载体pSDU1-tac-arsA酶切验证
• 4.2.2.6 抗砷基因arsC的克隆
• 4.2.2.7 抗砷质粒pSDU1-tac-Ars2 （L. ferriphilum）的构建
• 4.2.3 抗砷质粒pSDU1-tac-Ars1 （Plasmid R773）的构建
• 4.2.3.1 pSDU1载体片段的克隆
• 4.2.3.2 含有tac启动子的砷抗性基因Ars1的克隆
• 4.2.3.3 抗砷质粒pSDU1-tac-Ars1的构建
• 4.2.4 新型高拷贝抗砷质粒pSDU1-remob-tac-Ars1 （Plasmid R773）的构建
• 4.2.4.1 pSDU1-remob载体片段的克隆
• 4.2.4.2 含有tac启动子的砷抗性基因Ars1的克隆
• 4.2.4.3 抗砷质粒pSDU1-remob-tac-Ars1的构建
• 第五章 抗砷质粒在大肠杆菌中的抗性研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 培养基和培养条件
• 5.1.4 抗生素使用浓度
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 抗砷质粒在大肠杆菌中的砷抗性能力检测
• 5.2.1.1 L. ferriphilum调节型抗砷基因簇与经过基因工程改造后的抗砷基因簇抗砷性能的比较
• 5.2.1.2 L. ferriphilum经过基因工程改造后的抗砷基因簇与E. coli Plasmid R773抗砷性能的比较
• 5.2.1.3 质粒拷贝数对抗砷性能影响的研究
• 5.2.1.4 不同质粒的抗砷性能比较
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表