中国原产华东葡萄及其子代抗白粉病基因cDNA文库构建及EST序列分析

论文摘要

葡萄白粉病[Uncinula necator（Schw.）Burr.]是一种世界性真菌病害,给葡萄生产造成很大损失,培育抗病品种是控制葡萄白粉病的经济有效的途径。中国野生葡萄不仅具有抗病性,而且可以很好的遗传给后代,原产我国野生种华东葡萄（Vitispseudoreticulata W.T.Wang）株系“白河-35-1”,经多年研究证明它对葡萄白粉病表现出极强的抗病性,在其后代中“6-12-4”对白粉病也有较强的抗性;对其抗白粉病相关基因进行克隆研究不仅有利于阐明抗病机制,而且对葡萄抗白粉病研究及抗病基因的育种利用具有重要价值。本研究运用SMART技术构建中国野生抗病葡萄cDNA文库,经测序,运用生物信息学方法对获得的序列进行结构分析,以期获得与抗病有关的EST序列和抗病相关基因。取得如下主要结果:1.以中国野生华东葡萄株系“白河-35-1”为材料,于2006年7月7日,在西北农林科技大学葡萄种质资源圃进行接种实验;用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌,接种后立即套袋。在接种后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d剪去幼叶叶片,立即放置液氮中,用SDS/酚法提取总RNA;用不同接种时间白粉病病原菌[U.necator（Schw.）Burr.]诱导的叶片分别提取总RNA,然后混合提取的RNA样形成总RNA构建中国野生华东葡萄“白河-35-1”叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度为3.0×106pfu/ml,重组率为98.0%,扩增文库滴度为1×109pfu/ml,重组率为97%,插入片段主要分布在0.5-3.0kb之间,平均大小为1000bp左右。2以中国野生华东葡萄株系“白河-35-1”后代较抗病的株系“6-12-4”为材料,接种、取材、RNA的提取方法同“白河-35-1”,构建中国野生华东葡萄株系“6-12-4”叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度为2×106pfu/ml pfu/ml,重组率为98%,扩增文库滴度为8×108pfu/ml pfu/ml,重组率为97%,插入片段主要分布在0.5-3.0kb之间,平均大小为1000bp左右。3.通过对’6-12-4”文库随机测序,获得了181条质量好的cDNA序列,登Gen-Bank（登录号为FG579859-FG580039）;利用Blastx程序将其中的114条cDNA序列与GenBank的蛋白数据库进行同源性分析,78条EST序列与13类功能已知基因同源性有关;35条EST序列属于功能未知基因的片段;其余1条EST序列在GenBank中未检索到任何同源序列。在配准已知基因的78条cDNA序列中,20条EST序列与假定的抗病相关基因同源性很高。这些抗病相关基因包含于抗病反应的主要过程中,结果如下:包括与抗病信号转导有关的含有TPR结构域的小的富含谷氨酰胺的蛋白、钙调素、NYB类转录因子、组氨酸/天冬氨酸磷酸转移酶等;与防卫反应有关的蛋白酶类如糖基水解酶家族、病程相关蛋白14、富含亮氨酸蛋白、细胞色素P450、谷胱甘肽硫转移酶、肽基脯氨酰顺反异构酶等,与基础防御和非寄主抗性有关的金属硫蛋白、环化酶类、热激蛋白-90、查尔酮-黄酮类异构酶、;参与胁迫诱导的富含脯氨酸蛋白、ABA胁迫蛋白、紫外光抑制蛋白以及在抗病过程中与细胞自我保卫相关的半胱氨酸蛋白酶抑制剂和细胞壁物质纤维蛋白。这些物质在植物的抗病过程中起着重要作用。4通过对“白河-35-1”文库随机测序,得到1019个一致序列,其中包括785个单一序列,234个拼接序列。序列的生物信息学分析正在进行中。5在中国野生华东葡萄“6-12-4”cDNA文库获得一条全长钙调素基因,并对其进行生物信息学分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄白粉病简述
• 1.1.1 病原物
• 1.1.2 葡萄白粉病的发病规律
• 1.1.3 葡萄白粉病的为害特点
• 1.2 中国野生葡萄及抗病性简述
• 1.3 文库类型及应用
• 1.3.1 经典cDNA文库
• 1.3.2 消减cDNA文库
• 1.3.3 RACE cDNA文库
• 1.3.4 cDNA文库的应用
• 1.4 序列表达标签的应用
• 1.5 植物抗病研究简况
• 1.5.1 植物抗病性反应
• 1.5.2 植物抗病信号传导途径
• 1.5.3 抗病基因的结构特点
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.1.4 菌株与载体
• 2.1.5 培养基和常用溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA的提取及检测
• 2.2.2 文库的构建
• 2.2.3 序列测定
• 2.2.4 序列分析
• 2.2.5 文库中一个全长基因分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 中国原产华东葡萄抗白粉病cDNA文库构建
• 3.1.1 RNA的提取
• 3.1.2 双链cDNA的合成
• 3.1.3 cDNA的分级分离
• 3.1.4 cDNA浓度的确定
• 3.1.5 连接比例的确定
• 3.1.6 cDNA文库质量的鉴定
• 3.2 序列质量分析
• 3.2.1 序列拼接结果
• 3.2.2 EST序列功能分析
• 3.3 V CAM克隆及序列分析
• 3.3.1 结构分析
• 3.3.2 Blastn和Blastx分析结果
• 第四章 讨论
• 4.1 中国华东葡萄抗白粉病cDNA文库构建
• 4.1.1 总RNA的提取
• 4.1.2 文库质量评价
• 4.2 抗病相关基因
• 4.3 钙调素的抗病性研究
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介