论文摘要
背景昆虫高度复杂而灵敏的嗅觉系统用于识别环境中特异的化学气味分子。嗅觉在昆虫的觅食、寄主定位、寻偶、产卵等方面发挥着重要的生物学作用。对嗅觉分子机制的研究揭示了气味受体介导的气味分子与嗅觉神经元的专一性结合是昆虫嗅觉信号转导的重要生理学基础。每个昆虫嗅觉神经元通常表达两种气味受体：传统气味受体和嗅觉共同受体Orco（之前被称为Or83b）。每种昆虫只有一种Orco受体基因,且都为果蝇Orco的直系同源基因（ortholog）。各种昆虫的Orco组成了Orco受体家族（Orco family）。Orco通过异源二聚化与传统气味受体形成一个具有气味识别能力的复合体。Orco受体的主要功能是将传统气味受体运送至嗅觉神经元树突膜的表面,同时维持嗅觉受体复合体的构象稳定。对该受体基因的突变可以导致昆虫嗅觉功能的严重缺失。因此,有望以Orco受体作为潜在的分子靶标设计和发展新的害虫治理策略。丝光绿蝇Lucilia sericata Meigen和大头金蝇Chrysomya megacephala Fabricius,属于双翅目Diptera丽蝇科Calliphoridae,是两种重要的医学媒介昆虫。成虫能机械性传播多种病原体,危害人类健康。幼虫作为兼性体外寄生虫可以引起蝇蛆病,对畜牧业造成较大的经济损失。对于丽蝇嗅觉系统的研究先前主要集中在形态学、电生理学、行为学和化学生态学等方面,尚未开展有关嗅觉分子机制的研究。目的探究丽蝇嗅觉识别的分子基础,克隆气味受体基因并鉴定其功能,为更有效的利用嗅觉系统进行丽蝇综合治理提供理论依据和实践指导。方法1.采用RT-PCR方法和RACE策略克隆丝光绿蝇和大头金蝇Orco基因的全长序列。利用多种生物信息学软件分析新获得基因的核酸序列,预测其推导氨基酸序列的结构特征。2.使用半定量RT-PCR方法检测丝光绿蝇和大头金蝇Orco基因在成虫触角、下颚须、胸部、腹部、足部及产卵器中的表达情况。3.应用原位杂交技术检测大头金蝇Orco基因的mRNA在触角和下颚须中的分布情况。4.采用荧光定量PCR方法检测丝光绿蝇Orco基因在卵、幼虫、蛹及成虫四个发育阶段的相对表达水平。5.为鉴定丽蝇Orco基因的功能,利用RNA干扰技术沉默大头金蝇Orco基因的表达,通过Y型嗅觉仪验证大头金蝇对食物气味趋化性行为反应。结果1.克隆得到丝光绿蝇和大头金蝇Orco基因的全长序列,分别命名为LserOrco （GenBank登录号：HQ315862）和CmegOrco （GenBank登录号：HQ315861）。LserOrco和CmegOrco的开放读码框都为1437bp,编码478个氨基酸残基。两条基因推导的蛋白序列不仅彼此间具有98%的同一性,并且与先前报道的其他昆虫的同源受体之间具有高度的序列保守性。组成蛋白C末端的164个氨基酸为序列的极端保守区,氨基酸的同一性接近90%。LserOrco和CmegOrco的蛋白序列被预测都包含7个跨膜区,膜拓扑结构与其他昆虫Orco蛋白相同,跨膜方式为受体蛋白的N末端位于膜内C末端位于膜外。2. LserOrco和CmegOrco在雌性和雄性的触角及下颚须中呈强表达,在雌性的产卵器中存在微弱表达；在其他非嗅觉组织中表达模式有所差别,LserOrco在雌性和雄性的足部有少量表达,在胸部和腹部无表达,而CmegOrco在雌性和雄性的腹部有少量表达,在胸部和足部无表达。3. CmegOrco基因的mRNA在雌性和雄性的大部分嗅觉神经元中都有表达。在触角第3节（鞭节）和下颚须的末端膨大处被探针标记的阳性嗅觉神经元呈广泛性分布,而在触角第1节（柄节）呈零星分布。4. LserOrco在卵、幼虫及成虫三个阶段都有表达,而在蛹的早期（蛹壳形成后36hr左右）未见到表达。卵期相对表达量最低。在幼虫期,LserOrco的相对表达量从1龄期到2龄期逐渐增加,到3龄期开始下降。LserOrco在成虫嗅觉组织的表达水平远远高于卵和幼虫阶段的组织。其中,LserOrco在雌蝇触角中的相对表达量是卵的413倍。5.对CmegOrco基因实施RNA干扰后的24hr.48hr和72hr,使用RT-PCR对dsRNA注射组、无RNase水注射组与未注射组CmegOrco基因的mRNA进行检测。结果显示,与无RNase水注射组和未注射组相比,dsRNA注射组CmegOrco基因的表达量在48hr和72hr明显降低,说明随着时间增加,dsRNA对嗅觉器官中CmegOrco基因的表达起到了明显的抑制作用。无RNase水注射组与未注射组CmegOrco转录本的条带强度十分接近,说明无RNase水对CmegOrco基因表达没有影响。行为学实验显示,在假设大头金蝇对食物源和对照品的选择率相等（即H0）的前提下,未注射组（野生型）成虫被腐败猪肝产生的气味强烈吸引（x2=16.634,df=1,p=0.000）:同样,注射无RNase水的成虫对腐败猪肝产生的气味具有显著的趋向性（x2=12.281,df=1,p=0.000）.然而,注射dsRNA的成虫对食物气味的敏感性明显减弱,在腐败猪肝与对照品的选择上呈随机分布（x2=0.048,df=1,p=0.827）,接受H0,表明dsRNA沉默了CmegOrco基因的表达,从而显著损害了大头金蝇的嗅觉能力。结论1.首次从两种媒介昆虫丝光绿蝇和大头金蝇中克隆出气味受体基因。2.LserOrco和CmegOrco是果蝇Orco的直系同源基因,与Orco家族中的其他成员具有极为相似的结构特征和表达模式。3.RNA干扰技术结合化学趋化性行为学实验证实了新克隆的Orco受体是丽蝇发挥嗅觉功能的重要分子基础。4.基于Orco受体基因的RNA干扰技术可能为丽蝇的防治提供了新的有效途径。