橡胶树杂交种B1悬浮细胞再生体系建立及电激共转化研究

论文摘要

巴西橡胶树是多年生的异花授粉乔木,由于育种周期长、遗传基础较狭窄、多基因杂合状态,传统的杂交育种及杂种优势的利用受到限制。目前品种选育主要是用常规育种,其材料均来源于魏克汉系统的品系及其衍生的无性系。因此,探索其他育种方法,缩短育种周期,提高育种效率,克服传统育种的缺陷,具有重要意义。橡胶树细胞悬浮培养物具有生长旺盛,取材方便,易培养,试验重复性好,不受季节和环境条件的限制等优点,不仅可直接用于原生质体分离、培养与杂交,获取次生代谢产物,进行大规模的无性系繁殖,还可以在短期内在细胞水平筛选出所需要的突变体。本实验建立了橡胶树杂交种B1（Hevea brasiliensis×H.nitida）悬浮细胞再生体系,并利用悬浮细胞进行电激共转化研究,以期为今后橡胶树细胞工程研究奠定基础,主要结果如下：1.胚性细胞悬浮系的继代培养：取10mL细胞悬浮液接种到100mL三角瓶中,吸干培养基,添加20mL新鲜悬浮培养液（M1）[改良的MS培养基并添加2.0mg/L 2,4-D、1.Omg/LNAA、1.Omg/LKT、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5%（V/V）椰子水],7-9d继代一次,改变接种量和摇床转速,可以降低接种频率2.悬浮细胞诱导胚性愈伤组织：悬浮细胞接种到诱导愈伤组织培养基（M2）[改良的MS培养基并添加1.5mg/L 2,4-D、1.0mg/LNAA、0.5mg/LBAP、0.1g/L肌醇、70g/L蔗糖、5%（V/V）椰子水、2.2g/L植物凝胶]上可诱导出愈伤组织,诱导率达100%；同时可将愈伤组织接种到M2,进行长期继代与增殖,生长状态良好,胚性不会消失。3.体细胞胚诱导和成熟：将橡胶树B1品种胚性愈伤组织接种到体细胞胚诱导培养基（M3）[改良的MS培养基添加0.9mg/L KT、2mg/LBAP、0.01mg/L NAA、0.1mg/LGA、0.1mg/L肌醇、70g/L蔗糖、5%（V/V）椰子水、2.2g/L植物凝胶]上,可诱导体细胞胚的发生,继代1-2次,体细胞胚即可成熟。4.植株再生：将橡胶树B1品种成熟体细胞胚接种植株再生培养基（M4）[改良的MS培养基并添加0.5mg/LKT、0.2mg/LIAA、3.0mg/LGA3、70g/L蔗糖、5%（V/V）椰子水、2.2g/L植物凝胶]上,可诱导植株再生,植株再生率达16.6%。5.电激体系优化：采用均匀设计,以电场强度（X1）18水平,电容（X2）、蔗糖浓度（X3）2因素各6水平,电阻(X（4）、生长状态（X5）、DNA浓度（X6）、抽真空压强（X7）4因素各3水平作为考察因素,以瞬时表达率（Y1）和细胞成活率（Y2）为因变量,组成综合结果（Y1+Y2）,优化电激体系参数,得出最佳电激体系为：电场强度为1300v/cm、电容为10uF、蔗糖浓度为0.4M、电阻为2Kn、培养天数为3d、质粒浓度为90ug/ml、抽真空压强为600mbar时,悬浮细胞系的瞬时表达率、细胞成活率均能达到最优,分别为0.6555%和57.9262%。6.电激共转化分析：利用上述的电激参数,将标记基因表达框（GFP或GUS）:目的基因表达框（HbCBFl）:目的基因表达框（Kana）=1：1：1浓度进行电激共转化,成功获得橡胶树B1品种转化愈伤,对95个愈伤提DNA,进行PCR检测,其中10个呈阳性,初步得出共转化效率为1.05%,但没能进一步得到转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 橡胶树概述
• 1.2 植物细胞悬浮培养
• 1.2.1 细胞悬浮培养影响因子
• 1.2.1.1 外植体和基因型
• 1.2.1.2 愈伤组织状态
• 1.2.1.3 培养基的种类、组成
• 1.2.1.4 培养条件和培养方式
• 1.2.1.5 PH值
• 1.2.2 橡胶树细胞悬浮培养
• 1.3 巴西橡胶树遗传转化研究进展
• 1.4 植物基因工程研究进展
• 1.4.1 基因枪法
• 1.4.2 农杆菌介导法
• 1.4.3 电激法
• 1.4.4 花粉管通道法
• 1.4.5 PEG法
• 1.4.6 显微注射法
• 1.4.7 其他转化方法
• 1.5 转基因植物生物安全性与转化单元的关系
• 1.5.1 启动子的安全性
• 1.5.2 标记基因的安全性
• 1.5.3 载体框架序列的安全性
• 1.6 转基因植物生物安全性的研究现状
• 1.6.1 共转化
• 1.6.2 转座子法
• 1.6.3 位点特异性重组系统法
• 1.6.4 "清洁"载体转化系统构思的提出
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 培养基与培养条件
• 2.3 细胞悬浮系再生体系的建立
• 2.3.1 细胞悬浮系长期继代培养
• 2.3.2 悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织
• 2.3.3 体细胞胚的诱导和成熟
• 2.3.4 植株再生
• 2.4 电激转化体系的建立及优化
• 2.4.1 环形质粒和相应线性表达框的获得
• 2.4.1.1 环形质粒p35S-EGFP的制备
• 2.4.1.2 线性EGFP表达框的制备
• 2.4.1.3 PCR产物回收
• 2.4.2 电激法转化
• 2.4.2.1 电激缓冲液配方
• 2.4.2.2 电激转化操作步骤
• 2.4.2.3 瞬时表达率的测定
• 2.4.2.4 细胞成活率的测定
• 18（18¹×6²×3⁴）均匀设计优化电激影响因数'>2.4.2.5 U₁₈（18¹×6²×3⁴）均匀设计优化电激影响因数
• 2.5 电激共转化研究
• 2.5.1 质粒p35S-HbCBF1,p35S-GUS,p2301-HbCBF1的制备
• 2.5.2 线性GUS,KANA,HbCBF1表达框的制备
• 16（4⁵）正交设计优化PCR参数'>2.5.3 L₁₆（4⁵）正交设计优化PCR参数
• 2.5.4 电激共转化
• 2.5.5 KANA选择压对转化的影响
• 2.5.6 KANA压选择方法对转化的影响
• 2.6 转化愈伤的鉴定
• 2.6.1 转化愈伤EGFP观察
• 2.6.2 转化愈伤基因组DNA提取
• 2.6.3 基因组DNA的PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 胚性细胞悬浮系的继代培养观察
• 3.2 易碎胚性愈伤组织诱导
• 3.3 胚性细胞悬浮系与易碎愈伤组织系的保持与增殖
• 3.4 体细胞的诱导和成熟
• 3.5 植株的再生
• 3.6 电激转化体系优化研究
• 3.6.1 环形质粒的获得
• 3.6.2 线性表达框的制备
• 3.6.3 电激参数均匀设计试验结果分析
• 3.6.3.1 试验指标的测定结果
• 3.6.3.2 试验结果的回归分析
• 3.6.3.3 验证性试验
• 3.6.3.4 回归方程的预测能力分析
• 3.6.3.5 不同电激缓冲液EGFP瞬时表达研究
• 3.6.3.6 悬浮细胞不同状态下研究
• 3.7 电激共转化研究
• 3.7.1 PCR参数正交设计试验结果分析
• 3.7.2 选择压浓度和方法对转化的影响
• 3.8 转化愈伤的鉴定
• 3.8.1 转化愈伤EGFP观察
• 3.8.2 PCR鉴定转化愈伤
• 4 讨论
• 4.1 细胞悬浮系长期继代培养
• 4.2 悬浮细胞诱导易碎胚性愈伤组织
• 4.3 体细胞胚的诱导和成熟
• 4.4 植株再生
• 4.5 电激转化的建立及优化
• 4.6 电激共转化研究
• 5 结论
• 参考文献
• 附表1
• 附表2
• 缩略词
• 致谢