2，3-二氨基丙酸：苏云金芽胞杆菌中Zwittermicin A合成的直接前体物之一

论文摘要

Zwittermicin A,简称ZwA,中文名双效菌素,是由部分蜡状芽胞杆菌（Bacilluscereus）和苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）产生的一种新型广谱的氨基多元醇类抗生素,化学式C13H28N6O8。已知ZwA对卵菌纲、海藻、原生生物等比较低等的真核生物具有很强抑制作用,对大部分革兰氏阴性菌和一些特定的革兰氏阳性菌有中等的抑制作用,同时还可以抑制或杀灭一系列植物病原真菌。此外,ZwA还可以与Bt毒素协同作用从而增加Bt的杀虫活性。对ZwA合成所需要的前体物的预测已经有报道,推测ZwA合成需要5种前体物:L-丝氨酸（L-serine）,丙二酰辅酶A（malonyl CoA）,氨基丙二酰-ACP（Amino-malonyl-ACP）,羟基丙二酰-ACP（Hydroxy-malonyl-ACP）,2,3-二氨基丙酸（2,3-diamino-propionate）。本课题组在国内率先开展其生物合成基因簇的克隆及生物合成途径的研究,但ZwA的生物合成途径还没有一个完善的学说,只是基于16 kb DNA序列的假说。此16 kb的序列只包含假想前体物氨基丙二酰-ACP和羟基丙二酰-ACP合成的相关基因,没有对2,3-二氨基丙酸这种前体物合成基因进行预测和验证。所以本研究旨在完善对ZwA前体物的认识,从而推动对ZwA合成基因簇以及生物合成途径的研究,具有重要的理论研究意义。本研究是以获得的苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520 ZwA生物合成的67 kb的基因簇为基础,对此基因簇进行了生物信息学的分析,发现ZwA5A,ZwA5B和orf3三个基因与2,3-二氨基丙酸的合成相关。同源性比较显示ZwA5A和ZwA5B分别是半胱氨酸合成酶和鸟氨酸环化脱氨酶的同源物。通过同源交换插入,获得ZwA5A基因缺失突变体ZwA5A-。该突变体不再产生ZwA,用化学合成的D/L-2,3-二氨基丙酸添加到突变体ZwA5A-的发酵生长过程中,突变体ZwA5A-可以恢复产ZwA。这说明ZwA5A基因对ZwA的产生是必需的;在ZwA的产生过程中,化合物D/L-2,3-二氨基丙酸可以替代基因ZwA5A的功能。通过pGEX-6P-1载体,在大肠杆菌中超量表达了ZwA合成基因簇ORF3中的腺苷酰化功能域ZwAA。依赖于ATP的焦磷酸交换实验表明,腺苷酰化功能域ZwAA2可以识别并活化2,3-二氨基丙酸。上述结果证实,2,3-二氨基丙酸是ZwA生物合成过程中的直接前体物之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 Zwittermicin A的性质概况
• 1.1.1 Zwittermicin A的由来及其结构
• 1.1.2 Zwittermicin A与苏云金芽胞杆菌
• 1.1.3 培养条件对Zwittermicin A产量的影响及其纯化方法
• 1.1.4 Zwittermicin A的抑菌活性
• 1.1.5 Zwittermicin A的增效活性
• 1.2 Zwittermicin A生物合成的研究
• 1.2.1 Zwittermicin A的抗性基因zmaR
• 1.2.2 Zwittermicin A生物合成途径的相关研究
• 1.2.2.1 抗生素的合成途径
• 1.2.2.1.1 聚酮及聚酮合成酶
• 1.2.2.1.2 非核糖体肽及非核糖体肽合成酶
• 1.2.2.1.3 聚酮/非核糖体肽杂合途径
• 1.2.2.2 Zwittermicin A的生物合成途径推测
• 1.2.3 Zwittermicin A的生物合成基因簇尚不完整、合成途径尚不完善
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、质粒和引物
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和仪器
• 2.1.3.1 试剂
• 2.1.3.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA常规操作
• 2.2.1.1 质粒的制备与纯化
• 2.2.1.1.1 大肠杆菌质粒的制备与纯化
• 2.2.1.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的制备与纯化
• 2.2.1.2 DNA的体外重组操作
• 2.2.1.2.1 大肠杆菌总DNA的抽提
• 2.2.1.2.2 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提
• 2.2.1.3 重组质粒的转化
• 2法感受态制备及常规转化'>2.2.1.3.1 大肠杆菌CaCl₂法感受态制备及常规转化
• 2.2.1.3.2 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.1.4 PCR扩增
• 2.2.2 SDS-PAGE蛋白质电泳
• 2.2.2.1 菌体蛋白样品的制备
• 2.2.2.2 SDS-PAGE凝胶的制备
• 2.2.2.3 电泳、染色及脱色
• 2.2.3 ZwA的分离与检测
• 2.2.3.1 ZwA活性平板检测
• 2.2.3.2 ZwA的高效液相色谱检测
• 2.2.4 蛋白质的预测、表达、纯化与活性检测
• 2.2.4.1 腺苷酰化功能域的预测
• 2.2.4.2 腺苷酰化功能域的超量表达与纯化
• 2.2.4.2.1 腺苷酰化功能域的扩增
• 2.2.4.2.2 腺苷酰化功能域重组质粒的构建
• 2.2.4.2.3 腺苷酰化功能域重组菌株的超量表达及其纯化
• 2.2.4.2.4 腺苷酰化功能域对2,3-二氨基丙酸的特异性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 前体物2,3-二氨基丙酸
• 3.1.1 前体物2,3-二氨基丙酸的合成途径假设
• 3.1.2 前体物2,3-二氨基丙酸合成基因ZwA5A的插入突变研究
• 3.1.2.1 ZwA5A的插入突变
• -突变体'>3.1.2.2 2,3-二氨基丙酸体外喂养ZwA5A^-突变体
• -突变体'>3.1.2.3 体内回复突变ZwA5A^-突变体
• 3.2 腺苷酰化功能域的预测、表达与活性检测
• 3.2.1 腺苷酰化功能域的预测
• 3.2.2 腺苷酰化功能域的表达
• 3.2.2.1 腺苷酰化功能域的扩增
• 3.2.2.2 腺苷酰化功能域重组质粒的构建
• 3.2.2.3 腺苷酰化功能域重组菌株的超量表达
• 3.2.2.4 腺苷酰化功能域对2,3-二氨基丙酸的特异性检测结果
• 4 讨论
• 4.1 ZwA前体物2,3-二氨基丙酸orf3中编码基因的后续研究
• 4.1.1 2,3-二氨基丙酸orf3中腺苷酰化功能域活性检测
• 4.1.2 2,3-二氨基丙酸orf3中磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的研究
• 4.2 ZwA生物合成途径推导
• 4.2.1 前体物氨基丙二酰-ACP、羟基丙二酰-ACP和2,3-二氨基丙峻的从头合成
• 4.2.2 前体物的组装
• 4.2.3 ZwA骨架的修饰
• 4.3 ZwA合成基因簇中的功能未知基因非核糖体肽合成酶基因orf4、orf5
• 4.4 ZwA的跨膜转运以及ZwA产生菌株的自身免疫保护
• 致谢
• 参考文献
• 附录