转基因酿酒酵母产番茄红素的研究

论文摘要

番茄红素是存在于番茄、西瓜、红色萄萄柚等果实中的一种天然类胡萝卜素。1995年开始国外对番茄红素的功能性研究引起重视,并确认番茄红素具有较强的防癌和抗癌功能,尤其具有预防前列腺癌的功能。效果优于β-胡萝卜素。酿酒酵母遗传背景清楚,胞内含有番茄红素合成前体比较丰富,而且可以方便的应用于食品工业,在转基因方法产番茄红素的领域中,酿酒酵母因其诸多优点,而得到越来越多的重视和应用。目前应用于转基因酵母的类胡萝卜素合成酶基因均来源于细菌和真菌,本文首次将来自于药用草原黄花龙胆的类胡萝卜合成酶基因:八氢番茄红素合成酶基因（psy）、八氢番茄红素脱氢酶基因（pds、zds）。质粒YCp22-Gal-psy YEplac195-pds、YEplac181-zds（质粒为本实验室构建）经验证后逐一转入酿酒酵母w303菌株中,并得到了阳性转化子。对挑取的阳性转化子进行连续三次的发酵实验,得到了遗传性状比较稳定的一株转化菌株,使用酸热法提取色素物质,进行HPLC检测,与番茄红素标准品进行比对,证实了类胡萝卜素合成酶基因在转化菌株中得到表达,产生了番茄红素,并利用HPLC对样品定量,得到了转化菌株的原始番茄红素产生量60μg/g。本实验继续对此酿酒酵母阳性转化子的发酵培养基进行了探索,分别通过对速效碳源、迟效碳源、有机氮源、无机氮源、金属离子、中间代谢物的有效性和浓度的探索,最终确定了葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、苹果酸钠、柠檬酸钠、FeSO4、MgSO4这8种因素对番茄红素的产生是有着积极影响的,对这8种因素分别取三水平进行L2738的正交实验,最终得到了2.4%葡萄糖,1.2%蔗糖,1.07%蛋白胨,0.35%酵母粉,0.04%苹果酸钠,0.06%柠檬酸钠,0.01%FeSO4以及0.015%MgSO4作为最优的发酵培养基并使得番茄红素的产量提高了60%,初步达到了筛选培养基的目的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 类胡萝卜素类物质简介
• 1.1.1 类胡萝卜素类物质的结构特点
• 1.1.2 类胡萝卜素类物质的主要生理功能
• 1.2 番茄红素概况
• 1.2.1 番茄红素的理化性质
• 1.2.2 番茄红素在自然界中的分布
• 1.2.3 番茄红素的生物合成途径以及主要生产方法
• 1.3 微生物转基因生产番茄红素的热点及进展
• 1.4 酿酒酵母体内合成番茄红素
• 1.5 研究中的主要技术
• 1.6 研究目标、内容及方案
• 1.6.1 研究目标
• 1.6.2 研究内容
• 1.6.3 实验方案
• 第二章 将目的基因转入酿酒酵母
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株与引物
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 主要药品
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法
• 2.2.3 DNA 的限制酶消化
• 2.2.4 从琼脂糖中回收 DNA 片段
• 2.2.5 DNA 的连接反应
• 2.2.6 PCR 扩增
• 2.2.7 酵母菌转化方法
• 2.2.8 从酵母中回收质粒
• 2.2.9 转基因酵母菌株的色素提取（酸热法）
• 2.2.10 HPLC条件摸索与标准曲线测定
• 2.3 实验结果及分析
• 2.3.1 YEPlac181-zds检测结果
• 2.3.2 YEPlac195-pds检测结果
• 2.3.3 YCp22-Gal-psy 检测结果
• 第三章 转基因酿酒酵母发酵条件摸索
• 3.1 酵母菌体生长生物系指标的测定
• 3.1.1 菌体生长的的测定
• 3.1.2 番茄红素的测定
• 3.1.3 糖的测定方法
• 3.1.4 氨基氮的滴定方法
• 3.2 碳源的选择
• 3.2.1 速效碳源的选择
• 3.2.2 迟效碳源的选择
• 3.3 氮源的选择
• 3.3.1 氮源种类的选择
• 3.3.2 氮源浓度配比
• 3.4 无机盐的选择
• 3.5 其他种类无机盐的选择
• 3.6 各种因素的正交实验
• 3.7 结果与分析
• 3.7.1 碳源的选择
• 3.7.2 氮源的选择
• 3.7.3 无机盐的选择
• 3.7.4 其他种类无机盐的选择
• 3.7.5 各因素正交实验
• 3.8 总结与展望
• 3.8.1 全文总结
• 3.8.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢