肿瘤生物标志-Glypican-3临床应用价值的基础研究

论文摘要

背景/目的:原发性肝癌系世界高发的恶性肿瘤之一,在中国,肝癌的发病率甚高。现如今,这已不仅是一个医学问题,也是一个社会问题。随着影像学检查技术的进步,肝结节性病变越来越常见。然而,仅凭影像学特征常难以确定病灶性质,因此,对肝脏结节性病变进行病理学检查具有重要意义。但,迄今为止并无理想的免疫组化标记物用来鉴别肝脏结节性病变的性质。近年的研究发现,肝细胞癌（HCC）表达一种磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3,GPC3）,初步证实其可作为一种肿瘤结构标志物特异性表达于肝细胞癌、肝母细胞瘤等肿瘤细胞。此外,GPC3作为一种膜糖蛋白,其氨基端（N端）即可溶性GPC3片段可被分泌至细胞外并能够被检测到,因此在临床血清学诊断方面具有潜在价值。而自2006年Komori H等人报道GPC3蛋白中包含两种细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位以来,对GPC3的研究已不仅局限于其在诊断方面的应用价值,以GPC3为靶点的肿瘤免疫治疗逐步成为目前研究的热点。本文目的即通过对肝癌组织中GPC3蛋白的表达情况以及肝癌患者血清中GPC3蛋白进行研究,并证实GPC3蛋白包含的两种具有不同HLA限制性CTL表位肽的免疫学作用等几个方面对GPC3作为肿瘤生物标志物在诊断、鉴别诊断及肿瘤免疫治疗方面的临床应用价值进行评价。方法:通过免疫组织化学方法检测10对低分化肝细胞肝癌癌组织及癌旁组织和10例肝硬化组织标本中GPC3蛋白的表达情况。利用商品化的ELISA检测试剂盒,对HCC、肝硬化、慢性肝炎等多种肝脏疾病及胃肠肿瘤患者和健康供者血清中的GPC3蛋白进行了较大范围的诊断性检测。对45例HCC患者血清中GPC3蛋白及AFP进行联合检测,同时比较分析了经过TAE、RF和/或光子刀治疗前后的患者血清中GPC3蛋白与AFP的动态变化。此外,本文在证实GPC3在HCC组织中特异表达的基础上,还对GPC3是否可以作为肿瘤免疫治疗的新靶点进行了初步探讨。用体外表达的两段GPC3全长蛋白中CTL表位肽,分别为A肽GPC3298-306（EYILSLEEL）及B肽GPC3144-152（FVGEFFTDV）,作为免疫原诱导BALB/c小鼠体内免疫,同时将两种表位肽部分偶联血蓝蛋白（KLH）后分别免疫BALB/C小鼠。将36只雌性BALB/C小鼠随机分为6组,4个实验组及2个对照组,6只/组。第1、2实验组小鼠分别免疫单独的A肽及B肽;第3、4实验组分别免疫偶联KLH的A肽及B肽;第5、6组分别为单独免疫KLH的对照组和生理盐水空白对照组。最后一次免疫结束7天后取小鼠脾脏并分离淋巴细胞,以ELISPOT方法检测特异性斑点,计数活化的T细胞以判断两种肽是否可以诱导特异性免疫应答。同时采用流式细胞技术分析CD4+T和CDS+T细胞亚群的比例变化,以判断小鼠体内的免疫反应,尤其是细胞免疫。结果:免疫组织化学方法检测结果:阳性表现为棕色颗粒均匀地分布在肝癌细胞的胞浆区和胞膜上。10例肝细胞癌中有7例表达GPC3（70%）,其中2例低表达;在10例癌旁组织及10例肝硬化组织中均未发现GPC3的表达。同时GPC3的表达又具有细胞特异性,其在肝癌组织中的胆管上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及浸润的淋巴细胞上的表达均呈阴性。ELISA检测结果发现:HCC患者血清中GPC3浓度显著高于其他肝脏疾病、胃肠肿瘤及健康供者血清中的GPC3浓度。45例HCC中有29例GPC3（+）（64.4%）;肝硬化GPC3（+）（2/35,5.7%）;转移性肝癌GPC3（+）（2/20,10%）;肝囊肿GPC3（+）（1/15,6.7%）;而35例慢性肝炎10例脂肪肝等其他肝脏病变、胃癌、大肠癌患者及健康供者血清中GPC3蛋白均为阴性。在45例HCC患者中,AFP诊断阳性率为55.6%,而GPC3诊断阳性率达到64.4%。29例GPC3（+）患者中有11例患者血清中AFP（-）;25例AFP（+）患者中有7例患者血清中GPC3（-）,提示HCC患者血清中GPC3蛋白浓度升高与AFP无关,联合检测GPC3和AFP使诊断率显著提高至80%。同时发现,GPC3（+）AFP（-）患者中有3例为Ib期肝癌。通过对45例HCC患者进行临床分析,发现GPC3在血清中浓度的升高与肝癌直接相关而与肝炎等其它良性肝病造成的肝细胞损伤无关。而对治疗前后患者血样跟踪检测的结果发现,随着患者的肿瘤大小减小及数目减少,GPC3蛋白在血清中的浓度变化呈现了比AFP更稳定的下降趋势,表明GPC3具有比AFP更佳的特异性及灵敏性。ELISPO/实验检测结果显示,在刺激淋巴细胞分泌IFN-γ的水平上1、2组与空白对照组差异具有统计学意义（P<0.05）;3、4实验组与5、6对照组差异均具有统计学意义（P<0.05）;而1、2、3、4实验组间差异不显著（P>0.05）。以上实验均重复两次得到同样的结果。流式细胞技术检测分析发现第1、2组CD4+与CD8+T细胞比值高于空白生理盐水对照组,差异有显著性意义（P值均<0.05）。结论:GPC3蛋白在HCC组织上普遍的高表达,因此免疫组化方法检测GPC3蛋白可作为一项有价值的病理诊断的辅助手段,有助于提高肝细胞癌的确诊率。GPC3与AFP两种检测指标在血清学诊断上具有互补作用,联合检测有望提高HCC早期诊断的阳性率和特异性同时可对患者进行进一步的疗效判断及预后分析。我们通过小鼠体内实验证明体外表达的两种CTL表位肽可被特异性T细胞所识别,并诱导其活化,进而在小鼠体内引发特异性的免疫应答,尤其是细胞免疫,这就为针对GPC3新靶点的免疫治疗提供了强有力的理论依据。综上,我们认为GPC3蛋白具有很好的临床应用价值,但针对GPC3的特异性肿瘤免疫治疗能否广泛引用于临床,还需要更深入更进一步的实验论证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 GPC3蛋白在肝癌组织中特异性表达的临床意义
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 血清检测GPC3表达的临床意义
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 GPC3特异性CTL表位诱导体内免疫应答的基础研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录 缩略词中英文对照表
• 综述
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明