猪圆环病毒2型分子流行病学调查及其抗体的间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

根据GenBank中发表的2型猪圆环病毒（porcine circovirus type 2,PCV2）基因组序列,设计一对特异性核苷酸引物。通过对已知PCV2和对照病毒的PCR扩增,证明了所设计的引物可用于PCV2的特异性PCR检测。采集来自江苏扬州和泰州地区157个猪群的疑似猪圆环病毒感染的病料（脾脏、腹股沟淋巴结）并进行PCV2的检测,结果发现70.70%的猪群存在PCV2感染。进一步分析显示,单独脾脏的PCV2检出率为7.64%,单独淋巴结的PCV2检出率为21.65%,从脾脏和淋巴结同时检出PCV2的比例为41.40%。另外,对采自扬州某屠宰场的32份猪腹股沟淋巴结检测结果表明临床健康猪的PCV2感染率也高达71.88%。为确定PCV2江苏分离株可能存在的基因多样性,重新设计一对特异性引物,用PCR方法从分离的6株PCV2江苏分离株（TZ60607、TZ60804、YC60711、YZ60615、YZ60721、YZ70717）扩增出全基因组DNA片段,并克隆入质粒载体pGEM-T easy。通过氨苄青霉素抗性、蓝白斑特性以及酶切分析,获得6个含有相应片段的重组质粒,分别命名为pTZ60607、pTZ60804、pYC60711、pYZ60615、pYZ60721、pYZ70717。序列测定结果表明,6株病毒的基因组大小均为1767bp。应用DNAstar序列分析软件对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV2毒株进行同源性比较,并绘制系统发生树,结果发现所测6株毒株与这些参考株之间核苷酸序列同源性均很高,介于94.6%～100%之间。这6株分离株集中分布于中国分离株当中,与浙江株（AY678532,AY691169,AY510375）、福建株（DQ180393）、江苏株（DQ104422）亲缘关系较近,与多数中国分离株亲缘关系较近并形成较大的一簇,而与美国株（AF264041）、加拿大株（AF086836）遗传关系较远。为建立猪群PCV2的血清流行病学监测技术,以大肠杆菌表达的PCV2重组衣壳蛋白（His-CAP）为抗原,建立了用于检测PCV2抗体的间接ELISA法。通过对ELISA的反应条件比较,确定了His-CAP的最适包被浓度为6.4μg/mL,待检血清稀释度为1:40,羊抗猪IgG-HRP的工作浓度为1:5000。且该ELISA方法具有良好的特异性,与猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清没有交叉反应,可以用于PCV2抗体的检测。利用建立的间接ELIsA方法来自盐城地区不同猪场的175份血清样本进行了检测,结果发现70.29%为PCV2抗体阳性,这与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况是相符合的。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
• 1. 分类地位
• 2. 病原学
• 3. 致病性
• 4. 病毒基因组及主要结构和功能蛋白的特性
• 5. 猪圆环病毒2型的诊断
• 6. 猪圆环病毒2型的相关疾病
• 7. 防制措施
• 研究一: 猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立与应用
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 研究二: 江苏地区6株PCV2分离株全基因的克隆与分析
• 1. 材料和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 研究三: 猪圆环病毒2型抗体检测间接ELISA方法的建立
• 1. 材料和方法
• 2. 结果与分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 致谢