山羊精子基因转染方法及结合体外受精生产转基因胚胎的研究

论文题目: 山羊精子基因转染方法及结合体外受精生产转基因胚胎的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 孙新明

导师: 魏泓

关键词: 简单共孵育,电穿孔,脂质体,精子介导基因转移,体外受精,转基因胚胎,山羊

文献来源: 第三军医大学

发表年度: 2005

论文摘要: 精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer, SMGT)是一种简单而高效的生产转基因动物方法。该方法是根据动物精子具有自发结合外源DNA能力的原理,直接利用经DNA处理的转基因精子与卵母细胞体外受精后行胚胎移植或进行人工输精获得转基因动物,从而免去了显微注射法造成的原核损伤,便于转基因动物的研究和在生产中推广应用,是生产转基因动物的理想途径。SMGT的核心是高效、稳定的精子转染方法和有效的转基因动物生产技术,前者是提高转基因动物成功率的基础和关键,后者是高效生产转基因动物的保证。通过胚胎体外活体检测获取阳性胚胎后行移植是高效生产转基因动物非常重要的途径,建立稳定的体外受精技术体系是精子介导法生产转基因动物的有效措施,而通过活体采卵(OPU)获取卵母细胞是提高家畜体外受精效率的重要手段。但目前国内外利用精子介导法生产转基因家畜,尚未建立起一套高效的精子转染方法及有效的转基因动物生产途径,致使实验结果出现很大的随机性和不确定性,最终导致转基因效率不稳定。在山羊,目前缺乏对精子介导转染方法的系统比较研究,甚至有的方法(如电穿孔法)尚未建立,应用精子介导法生产转基因山羊的研究报道更少;也未见利用精子介导法通过体外受精制备阳性胚胎后行移植获取转基因山羊的研究报道。鉴于此,本实验就2部分实验内容进行研究,第一部分就精子介导转染外源基因的三种常规方法,即外源DNA与精子简单共孵育法、电穿孔导入法和脂质体介导法中各种因素对精子转染外源基因效率的影响进行探讨,优化精子转染程序,并通过比较,筛选一种简便、稳定、高效的精子介导转染方法。第二部分应用建立的山羊精子介导基因转移(SMGT)技术结合体外受精(IVF)探讨制备转基因山羊胚胎的有效途径,并对IVF相关技术环节对生产胚胎的影响因素进行研究,同时探讨活体采卵(OPU)来源卵母细胞的受精能力,以优化山羊胚胎体外生产条件,为生产转基因山羊的研究提供参考依据。在第一部分实验中,采集公羊精液,用洗精液1500 rpm/min×5min离心洗涤后调节精子浓度至0.5~1×107个/mL,按0.5~1μg/0.5~1×107个精子的浓度加入末端标记的

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论文正文山羊精子基因转染方法及结合体外受精生产转基因胚胎的研究

前言

第一部分山羊精子基因转染方法的优化、筛选

摘要

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 质粒提取、鉴定与标记

2 简单共孵育法介导山羊精子转染外源DNA 实验结果

3 山羊精子电穿孔转染外源DNA 实验结果

4 脂质体法介导山羊精子转染外源DNA 实验结果

5 精子介导方法的比较、筛选

讨论

1 精子与外源DNA 简单共孵育法、电穿孔导入法和脂质体法介导山羊精子转染外源DNA 的可行性

2 精子介导转染外源DNA 方法的比较

3 影响精子与外源DNA 共孵育转染效率的因素

4 电穿孔介导山羊精子转染外源DNA 的影响因素

5 脂质体介导法对山羊精子转染外源DNA 效率的影响因素

小结

参考文献

附图

第二部分精子介导法通过体外受精制备转基因山羊胚胎的研究

摘要

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 体外受精影响因素

2 利用精子介导法制备转基因胚胎结果

讨论

1 利用精子介导法通过体外受精及“试管”胚体外活体检测制备转基因山羊胚胎的可行性

2 体外受精影响因素

小结

参考文献

附图

全文总结

致谢

文献综述精子介导法生产转基因动物研究进展

参考文献

博士在读期间发表的论文

发布时间: 2006-10-19

参考文献

[1].绵羊精子膜蛋白基因的表达研究[D]. 娜仁花.内蒙古大学2006
[2].两种精子膜蛋白的基因表达研究[D]. 刘强远.中国协和医科大学1990
[3].马鹿精子膜蛋白纯化与理化性质分析[D]. 徐境羚.东北林业大学2007
[4].抗牛精子膜蛋白单链抗体基因的克隆与表达[D]. 杨树洪.中国农业大学2004

山羊精子基因转染方法及结合体外受精生产转基因胚胎的研究

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