蛋白酶抑制剂的制备及其抑制狭鳕鱼糜凝胶劣化的研究

论文摘要

鱼糜是一种经粉碎和漂洗后,主要由可溶性肌原纤维蛋白组成的鱼肉制品。鱼糜中残留的蛋白酶可引起鱼糜凝胶结构的破坏,从而导致鱼糜制品品质及商业价值的下降。蛋白酶抑制剂可用于抑制鱼糜凝胶的降解。本研究选取鲑鱼的卵和血浆作为原材料以提取蛋白酶抑制剂。通过酸处理、超滤浓缩和木瓜蛋白酶亲和柱纯化,从鲑鱼卵中纯化出了一种cystatin,其纯化回收率、比活力和纯化倍数分别为0.4%、1.54 U/mg和192.6倍。SDS-PAGE检测发现其分子量为13 kDa。氨基酸测序发现其N-末端为N-Gly-Leu-Ile-Gly-Gly-Pro-Met-Asp-Ala-Asn-C,该序列与鲑鱼其它组织中的cystatin的组成完全一致。通过使用木瓜蛋白酶亲和柱,从鲑鱼血浆中纯化出了一种kiniongen,该纯化的回收率、比活力和纯化倍数分别为0.94%、3.84 U/mg和30.36倍。SDS-PAGE与FPLC的检测表明其分子量为70 kDa。抑制活性染色表明,该抑制剂仅在非还原条件下可检出。PAS染色表明该抑制剂属于糖蛋白。以木瓜蛋白酶作为目标酶,鲑鱼卵cystatin的抑制能力最强;鲑鱼血浆kiniongen的抑制能力高于玻璃鱼卵抑制剂I、池沼公鱼抑制剂和另一种鲑鱼卵抑制剂;以组织蛋白酶L作为目标酶,鲑鱼卵cystatin的抑制能力略低于玻璃鱼卵抑制剂II,高于其他抑制剂;鲑鱼血浆kininogen的抑制能力高于狭鳕卵抑制剂、玻璃鱼卵抑制剂I和鲑鱼卵抑制剂。鲑鱼卵cystatin和鲑鱼血浆kininogen具有广范围的酸碱和热稳定性。在pH 5–8的范围内,鲑鱼卵cystaitn的活性几乎无损失。在pH 6–9的范围内,鲑鱼血浆kininogen可保留60%以上的抑制活力。鲑鱼卵cystatin在70°C以下处理30 min,可保留大于50%的活性。鲑鱼血浆kininogen在60°C处理30 min,可保留50%的活性。鲑鱼卵cystatin与鲑鱼血浆kininogen主要在20–50°C的范围内表现出抑制活性。Dixon-plot作图发现,鲑鱼卵cystatin属于竞争性抑制剂,其抑制常数为2.12 nM;鲑鱼血浆kininogen属于非竞争性抑制剂,其抑制常数为105.32 nM。通过合成编码鲑鱼卵cystatin的DNA,采用pYES2NT/C质粒,以啤酒酵母YPH 499为宿主,进行了鲑鱼卵cystatin的重组表达。诱导表达后,分别使用选择性镍亲和柱和乙醇沉淀法进行重组cystatin的纯化,其中亲和纯化的回收率、比活力和纯化倍数分别为61.23%、7.45 U/mg和5.60倍。SDS-PAGE检测发现,重组cystatin的分子量为35 kDa,推测其发生了双体交联。与天然鲑鱼卵cystatin相比,重组cystatin的抑制活力有所下降,在酸性范围内的稳定性也有所下降,但其热稳定性得以增强。采用响应面法进行了摇瓶规模啤酒酵母YPH 499生产重组cystatin的优化研究,发现在培养基pH为5.7,诱导时间为6.7 h,诱导辅助剂的添加量为5.6 g/L时,重组cystatin的产量最大,可达0.57 U/mL。该研究结果与重复实验结果相一致。在摇瓶优化研究的基础上,进行了发酵罐中搅动速率和通气速率影响啤酒酵母YPH 499生产重组cystatin的优化研究,发现在350 rpm的搅动速率结合1.0 vvm的通气速率的发酵条件下,发酵罐中重组cystatin产量达到最大,为0.56 U/mL。该研究结果与重复实验结果相一致。将纯化的重组cystatin添加到狭鳕鱼糜中,进行了鱼糜凝胶劣化的抑制研究。亲和纯化的重组cystatin,添加量为100μg/g时,其对鱼糜凝胶劣化的抑制率可达到90%以上。在该添加剂量下,凝胶的破碎力和变形量分别增加了4.5倍和30%。同时,其可榨出水分含量由17.85%减至6.27%,白度由49.78增加至52.60。SDS-PAGE检测表明,通过添加重组cystatin,可显著抑制蛋白酶引起的肌球蛋白的降解。重组cystatin的抑制效果显著强于蛋清粉。醇沉纯化的重组cystatin也可有效抑制鱼糜凝胶劣化,通过添加500μg/g的醇沉重组cystatin,可使凝胶的破碎力和变形量增加2.7倍和10%。因此,可将重组cystatin用于抑制狭鳕鱼糜的凝胶劣化。

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摘要

Abstract

前言

1.鱼糜资源

2. 鱼糜的凝胶过程

3. 鱼糜中的酶类

4. 鱼糜凝胶劣化的控制

第一章蛋白酶抑制剂的筛选

1. 材料

2. 方法

2.1 粗血浆蛋白的制备

2.2 溴化氢–木瓜蛋白酶–琼脂糖凝胶48 亲和介质的制备

2.3 蛋白酶抑制剂的纯化

2.3.1 鲑鱼卵中cystatin 的纯化

2.3.2 鲑鱼血浆中kininogen 的纯化

2.4 蛋白酶抑制活性的检测

2.4.1 半胱氨酸蛋白酶抑制活性的检测

2.4.1.1 木瓜蛋白酶抑制活性的检测

2.4.1.2 组织蛋白酶L 抑制活性的检测

2.4.2 丝氨酸蛋白酶抑制活性的检测

2.5 电泳

2.5.1.5 DS–PAGE

2.5.2 抑制活性染色

2.5.3.P AS-染色

2.6. FPLC

2.7 抑制剂的酸碱稳定性、热稳定性和活性

2.8 蛋白质浓度

2.9 抑制常数

2.10. N -端氨基酸测序

3. 结果与讨论

3.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化

3.1.1 鲑鱼卵中抑制剂的纯化

3.1.2 鲑鱼血浆中抑制剂的纯化

3.2 电泳

3.2.1 鲑鱼卵抑制剂的纯度与分子量

3.2.2 鲑鱼血浆抑制剂的电泳结果

3.2.2.1 鲑鱼血浆的抑制活性染色

3.2.2.2 鲑鱼血浆抑制剂的纯度与分子量

3.2.2.3 鲑鱼血浆抑制剂的PAS-染色

3.3 抑制剂的抑制活性比较

3.4 抑制剂的酸碱稳定性与热稳定性和热活性

3.4.1 抑制剂的酸碱稳定性

3.4.2 抑制剂的热稳定性

3.4.3 抑制剂的热活性

3.5 抑制剂的抑制类型及抑制常数

3.5.1 鲑鱼卵cyatatin

3.5.2 鲑鱼血浆kininogen

3.5.3 抑制常数的比较

3.6.N -端氨基酸测序

3.7 小结

第二章鲑鱼卵cystatin 的重组表达及其发酵生产条件优化

1. 材料

2. 方法

2.1 鲑鱼卵cystatin 编码DNA 的合成

2.2 鲑鱼卵cystatin 编码DNA 在啤酒酵母中的转化

2.3 重组质粒的稳定性

2.4 重组菌株的培养及重组cystatin 的诱导表达

2.5.R C 的检测

2.6.R C 的纯化

2.6.1 亲和纯化

2.6.2 乙醇沉淀纯化

2.7.RC 的性质研究

2.7.1 抑制活性

2.7.2 酸碱稳定性

2.7.3 热稳定性

2.8.R C 发酵生产的优化

2.8.1 摇瓶规模RC 生产的优化

2.8.2 发酵罐中RC 生产的优化

2.8.3 验证实验

2.9 检测分析

2.9.1 微生物浓度

2.9.2 溶氧检测

2.9.3 葡萄糖和半乳糖含量检测

2.10 数据分析

3. 结果与讨论

3.1 重组用微生物的选择

3.2 鲑鱼卵cystatin 编码DNA

3.3 鲑鱼卵cystatin 的质粒转化及验证

3.4 重组质粒的稳定性

3.5 重组菌株的培养及RC 的诱导表达

3.6.RC 的纯化

3.6.1 亲和纯化RC

3.6.2 乙醇沉淀纯化RC

3.7.RC 的性质研究

3.7.1 抑制活性的比较

3.7.2 酸碱稳定性的比较

3.7.3 热稳定性的比较

3.8.RC 的生产优化

3.8.1 摇瓶培养的优化

3.8.1.1 星点设计

3.8.1.2 培养基pH、诱导时间和诱导辅助剂的添加量对RC 产量的影响

3.8.1.3 最佳培养条件的预测

3.8.1.4 摇瓶培养优化验证

3.8.2 发酵罐培养的优化

3.8.2.1 搅动速率的影响

3.8.2.2 通气速率的影响

3.8.2.3 发酵罐培养优化验证

3.9 小结

第三章利用 RC 抑制狭鳕鱼糜凝胶劣化的研究

1. 材料

2. 方法

2.1.R C 对鱼糜降解的抑制能力

2.2 鱼糜凝胶的制备

2.3 凝胶结构分析

2.4 凝胶白度检测

2.5 可榨出水分检测

2.6 鱼糜凝胶中蛋白质溶解度的测定

2.7 蛋白质图谱

2.8 数据分析

3. 结果与讨论

3.1 亲和纯化的RC 对鱼糜凝胶劣化的抑制作用

3.1.1.R C 对狭鳕鱼糜降解的抑制作用

3.1.2.R C 对鱼糜凝胶结构的作用

3.1.3.R C 对鱼糜凝胶可榨出水分含量和白度的影响

3.1.4.R C 对鱼糜凝胶蛋白质溶解度的影响

3.1.5.R C 对鱼糜凝胶蛋白质降解的影响

3.2 乙醇沉淀纯化的RC 对鱼糜凝胶劣化的抑制作用

3.2.1 粗RC 对鱼糜凝胶结构的作用

3.2.2 粗RC 对鱼糜凝胶可榨出水分含量和白度的影响

3.3 小结

第四章结论

论文创新点

后续工作计划

参考文献

个人简历

论文发表情况

致谢

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