脊椎动物多倍体祖先二倍化的分子机制研究

论文摘要

近来,随着大量模式生物全基因组测序工作的完成,系统发育基因组学和比较基因组学的研究证明现存的典型二倍体脊椎动物都是从多倍体祖先进化过来的。但脊椎动物的多倍体祖先是如何克服基因组加倍带来的不利影响,通过怎样一种分子机制来完成这种二倍化的转变,在严酷的生存斗争中获得优势并进而演变出今天如此众多的脊椎动物物种,仍是一个引人入胜的重大生命科学之谜,也是目前研究物种进化演变的核心内容。为此,我们选择还处于恢复二倍化过程中的金鱼作为研究对象,通过对金鱼vsx1基因5’端侧翼序列的分析,确定了该基因的拷贝数目,进而分析了不同拷贝的转录表达差异以及各拷贝转录能力差异产生的原因,以为揭示脊椎动物的多倍体祖先在基因组加倍后冗余基因拷贝沉默,丢失和二倍化的分子机制提供新的线索。本研究的主要研究结果和结论如下:1.通过对金鱼vsx1基因5’端侧翼启动子区域序列分析,单倍体单胚胎基因组以及不同发育时期胚胎基因组的分析,确定了vsx1基因在金鱼基因组中有vsx1 A1和vsx1 A2两个不同的基因座位。2.通过5’RACE分析和特异性RT-PCR分析确定了vsx1 A1是能进行转录的有功能的拷贝,vsx1 A2是不能进行转录、并已积累了大量突变的无功能拷贝。说明金鱼vsx1基因在加倍后已经完成了二倍化过程,其恢复二倍化不是通过基因功能的分化实现的,而是通过其中的一个拷贝的沉默和无功能化来实现的;多余拷贝的无功能化不是产生了无功能的转录产物,而是基因转录活性的丧失。3.通过对vsx1 A1基因近端启动子区域序列所控制的报告基因的表达模式与vsx1 mRNA原位杂交空间模式的比较分析,以及对不同物种vsx1基因近端启动子区域的保守性序列分析,确定了vsx1基因转录调控的关键区域。4.通过对vsx1 A1和A2基因转录调控的相应关键区域CpG岛的亚硫酸氢盐测序比较分析确定了沉默拷贝vsx1 A2与转录拷贝vsx1 A1一样,其近端启动子区域在精子、卵子、不同发育阶段胚胎和不同成体组织材料中都没有发生甲基化。说明启动子CpG岛DNA甲基化与vsx1 A2基因不能进行转录表达无关。与植物人工多倍体中表观遗传修饰在剂量控制和二倍化中起重要作用不同,DNA甲基化显然没有参与金鱼四倍体祖先中vsx1基因二倍化的过程。5.vsx1 A2在启动子功能关键区域内存在较多的碱基突变,这些序列上的变化导致了一个与基因表达相关的活化转录因子结合位点的丧失和二个抑制转录因子结合位点的出现,表明碱基突变很可能是造成该拷贝不能在正常发育过程中进行转录表达的根本原因。上述研究结果提示在脊椎动物通过基因加倍而进化的过程中,基因组的二倍化不是一个通过表观遗传修饰立即实现的快速过程,而是一个通过突变的不断积累来实现的相对慢长的过程。突变是造成脊椎动物基因组加倍后冗余拷贝丢失的根本原因。但由于突变是一个相对比较慢的过程,这些突变所导致的基因沉默和二倍化显然不可能是该物种在基因组加倍后快速适应多倍体状态,保证其生存竞争能力的最初原因。脊椎动物的多倍体祖先之所以能够在进化过程中保持生存竞争的优势并进而演变出今天如此众多的脊椎动物物种,更可能是因为在基因组加倍之前或者在同时其生殖方式已经发生了改变,具备了不完全依赖于两性生殖和减数分裂机制的生殖能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 基因组进化与物种进化的关系
• 1.2 基因组加倍对物种的可能影响
• 1.3 基因组加倍后二倍化的机制研究进展
• 1.4 金鱼是研究脊椎动物基因组二倍化分子机制的合适古多倍体脊椎动物
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章:金鱼vsx1基因座位数目的确定
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 雌核发育二倍体和单倍体,以及正常二倍体金鱼胚胎的获得
• 2.2.3 金鱼基因组DNA的提取
• 2.2.4 基因组步行法获得vsxl基因上游启动子序列
• 2.2.5 目的片段克隆与测序
• 2.2.6 基因特异性PCR检验及单倍体基因组分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 金鱼vsx1基因的基因组步行PCR扩增结果
• 2.3.2 金鱼不同vsx1基因座位的确定
• 2.4 小结
• 第三章:金鱼vsx1基因加倍后二倍化的方式
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 不同vsx1基因座位启动子序列的分析
• 3.2.2 RNA提取
• 3.2.3 5'RACE试剂盒扩增金鱼vsx1基因cDNA全长序列
• 3.2.4 vsx1不同基因座位RT-PCR分析
• 3.2.5 金鱼整胚原位杂交
• 3.2.6 金鱼vsx1 A1基因启动子控制的报告基因载体的构建
• 3.2.7 显微注射
• 3.2.8 金鱼及不同物种vsx1基因座位启动子序列的进化关系分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 金鱼vsx1 mRNA非编码区5'RACE分析
• 3.3.2 金鱼不同vsx1基因转录能力的特异性PCR分析
• 3.3.3 金鱼vsx1 A2基因是已经沉默的假基因
• 3.3.4 金鱼vsx1 A1基因启动子组织特异性转录调节关键区域的确定
• 3.3.5 脊椎动物vsx1基因启动子近端区域是高度保守的
• 3.4 小结
• 第四章:金鱼vsx1基因冗余座位沉默的分子机制
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 金鱼vsx1 A1和A2基因CpG岛预测和亚硫酸氢盐测序引物设计
• 4.2.2 金鱼基因组DNA亚硫酸氢钠修饰
• 4.3 结果
• 4.3.1 金鱼vsx1 A基因座位启动子表达调控区域的表观遗传差异
• 4.3.2 金鱼vsx1 A2基因座位启动子区域突变序列分析
• 4.4 小结
• 第五章 讨论与总结
• 5.1 金鱼vsx1基因加倍后二倍化的方式
• 5.2 金鱼vsx1基因的进化演变
• 5.3 金鱼基因组加倍后冗余基因座位沉默和丢失的可能分子机制
• 5.4 脊椎动物四倍体祖先基因组加倍后可能的最初适应机制
• 5.5 金鱼vsx1 B序列产生的可能机制
• 参考文献
• 博士学习期间论文发表情况
• 致谢