骨髓间质干细胞标记及再生肾样细胞的研究

论文摘要

目的建立PKH26、DAPI标记骨髓间质干细胞（mesenchymalstem cell，MSC）的方法，并探讨标记MSC的基本生物学活性；SD大鼠经50％的甘油肌内注射建立大鼠急性肾功能衰竭（acute renalfailure，ARF）模型，评价经尾静脉注射的MSC对大鼠ARF的治疗效果及体内外初步探讨其可能机制。方法MSC按PKH26、DAPI标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜（confocol）、流式细胞分析仪（FCM）等观察细胞生长状态和荧光标记活性变化；应用RT-PCR检测标记后MSC的nucleostemin及Bmi-1基因的表达；选用碱性磷酸酶（ALP）染色、Von kossa染色及骨形成蛋白3（BMP3）基因表达分析等技术，观察标记后MSC体外分化成骨细胞的特性；SD大鼠经50％的甘油肌内注射建立大鼠ARF模型，尾静脉注射MSC，综合运用临床生物化学、分子生物学、免疫组织化学、病理学、荧光原位杂交（FISH）等技术，评价MSC的治疗效果并找寻修复肾损伤的机制。体外利用Transwell培养板将大鼠MSC与受损肾组织共培养，运用confocol、RT-PCR、巢式PCR、荧光定量PCR鉴定细胞是否能分化为肾小管样上皮细胞，进一步佐证MSC的治疗修复机制。结果PKH26标记后细胞呈红色荧光，DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光，荧光的强度随着荧光染料浓度的增加而递增，并与传代时间和代数相关；标记后细胞生长状态良好，基本生长特性如传代培养和生长曲线无明显改变；细胞nucleostemin及Bmi-1基因表达未见改变；标记MSC诱导后ALP、Von kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征，并表达BMP3基因；成功建立大鼠ARF模型，ARF大鼠肾组织内具有较多的外源MSC，其他组织如心、肝、肺、脑也可见少量的外源MSC；利用胎儿MSC进行的定位实验中，在大鼠的心、肝及不同肾脏部位扩增出人17α卫星DNA序列。FISH实验显示大鼠冰冻肾脏切片中可见人源性细胞。MSC实验组大鼠血清肌酐、尿素氮下降水平较对照组具有明显的差异（P＜0.05）。实验组大鼠肾脏恢复情况较对照组有明显改善。体外共培养后，大鼠MSC形态由长梭形变为圆形，并且高表达上皮细胞特异性基因CK18和肾小管上皮细胞特异性基因AQP1。结论PKH26、DAPI可稳定标记大鼠骨髓MSC并能传代培养，标记后细胞形态、生长活力及多向分化潜能等无明显影响，该技术可用于追踪MSC转归、可塑性及干细胞移植方面的实验研究；外源MSC体内能够归巢到受损肾脏，并能有效地治疗大鼠ARF。体外受损肾组织能诱导大鼠MSC分化为肾小管样上皮细胞。本研究为ARF的有效治疗和肾损伤的修复等提供新的实验模型和依据，为临床治疗肾脏疾病开辟一条新途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTARCT
• 第一章 绪论
• 1.1 干细胞
• 1.2 间质干细胞
• 1.2.1 MSC的来源
• 1.2.2 MSC的分离培养方法
• 1.2.3 MSC的生物学特性
• 1.2.4 MSC应用的优点
• 1.3 MSC标记
• 1.3.1 GFP标记技术
• 1.3.2 荧光原位杂交技术
• 1.3.3 PKH26标记技术
• 1.3.4 DAPI标记技术
• 1.3.5 5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术
• 1.4 MSC可塑性机制和意义
• 1.4.1 MSC的可塑性
• 1.4.2 MSC可塑性机制
• 1.4.3 MSC可塑性的意义
• 1.5 MSC与肾脏疾病
• 1.5.1 MSC在肾脏疾病中的作用
• 1.5.2 MSC作为转基因载体治疗肾脏疾病
• 1.5.3 MSC移植治疗的机制及存在的问题
• 1.6 MSC临床应用展望
• 第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究方法
• 2.3 实验设计方案
• 2.4 研究意义
• 第三章 PKH26、DAPI标记大鼠骨髓间质干细胞的实验研究
• 3.1 试剂与仪器
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 MSC的分离和培养
• 3.2.2 PKH26、DAPI标记MSC
• 3.2.3 细胞动力学检测
• 3.2.4 流式细胞分析
• 3.2.5 诱导标记MSC分化成骨细胞及细胞化学染色
• 3.2.6 RT-PCR
• 3.3 结果
• 3.3.1 MSC形态学特点
• 3.3.2 染色结果
• 3.3.3 细胞动力学检测
• 3.3.4 标记MSC传代特征
• 3.3.5 诱导成骨细胞的ALP染色和VonKossa染色
• 3.3.6 Nucleostemin,Bmi-1和BMP3基因表达
• 3.4 讨论
• 第四章 骨髓间质干细胞在大鼠急性肾功能衰竭中的作用研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 MSC分离和培养
• 4.2.2 大鼠ARF模型建立
• 4.2.3 DAPI标记的大鼠MSC在ARF大鼠体内定位实验
• 4.2.4 胎儿MSC在ARF大鼠体内定位实验
• 4.2.5 治疗效果
• 4.2.6 治疗机制
• 4.3 讨论
• 第五章 体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为肾小管样上皮细胞的研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 大鼠MSC的分离和培养
• 5.2.2 大鼠ARF模型建立
• 5.2.3 共培养后细胞形态学变化
• 5.2.4 共培养后细胞肾小管上皮细胞特异性基因表达变化
• 5.2.5 荧光定量PCR鉴定共培养后细胞CK18表达
• 5.3 讨论
• 结论及展望
• 一、结论
• 二、展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文