外周血清中丙型肝炎病毒RNA的检测并应用基因芯片法对其基因分型的研究

论文摘要

目的 目前对丙型肝炎病毒的临床检测多采用血清学方法,第三代酶免疫法的敏感性和特异性都达到了99%。但由于人体的免疫应答有时效性和抗体产生窗口期等因素,使得检测结果有一定的时间差异。随着临床用药,病毒在体内被清除和抑制,使抗体产生较大波动,这就需要一种更为准确的方法来进行检测。病毒RNA的检测是一种很好的补充方法。只要有病毒存在,不管其是否复制,都可以检测到病毒RNA,可以不受人体免疫系统的影响。本实验设计用逆转录套式多聚酶链式反应（RT-nPCR）的方法直接检测外周血中的丙型肝炎病毒RNA,以此来判断病毒的存在与否。 丙型肝炎病毒的基因变异性很大,基因型别很多。基因型与病情的轻重,干扰素治疗的敏感性,预后的好坏等有一定的关系,故基因分型在流行病学和抗病毒治疗等方面有一定意义。基因分型的方法很多,本实验设计一种核酸杂交与微阵列基因芯片结合的方法判断丙型肝炎病毒的基因分型,探索一种快速、简便、费用低的检测方法,以便临床大规模检测丙型肝炎病毒的基因型别。 方法 参照文献研究丙型肝炎病毒的核苷酸序列及其序列多样性,并根据核苷酸的同源性大小分析其基因型别的差异。查阅NCBI病毒基因库,比对同源序列,设计丙型肝炎病毒RNA5′末端非编码区的通用PCR引物,并用地高辛标记。在此区域设计不同基因型的寡核苷酸探针序列,将寡核苷酸探针固定在经过修饰的玻璃片上制成微阵列芯片。提取临床血清样本中的病毒RNA,经逆转录多聚酶链式反应扩增,与探针杂交,经NBT/BCIP显色,将结果转印在硝酸纤维膜上,分析分型结果。 结果 丙型肝炎病毒感染者血清60例,电泳条带清晰,HCV-RNA阳性,芯片杂交可以分型。基因芯片分型结果与核苷酸测序标准分型结果符合56例,卡方（χ2）检验结果（P>0.05）显示无明显统计学差异。无丙型肝炎病毒感染者血清20例,无电泳条带,HCV-RNA阴性,芯片杂交结果阴性。纤维膜显色结果清晰,肉眼可见,判读方便,可永久保存。

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