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蒺藜皂苷单体B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

2020-12-11阅读(283)

蒺藜皂苷单体B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

论文摘要

血栓性疾病会导致心肌缺血、心功能下降、细胞形态改变、死亡,最终导致心力衰竭的发生。临床上常采用血栓溶解、经皮冠状动脉介入治疗或非体外循环冠状动脉旁路移植术等,恢复缺血区血液灌注。然而,再灌注恢复缺血区血流常会导致比单纯缺血更严重的损伤,称为缺血再灌注损伤。在急性冠脉综合征中,缺血再灌注损伤是一个常见的病理过程。治疗心肌缺血再灌注损伤的有效方法是缺血预适应,但在临床上常难以做到,因此寻找有效药物仍是治疗心肌缺血的关键。蒺藜皂苷（gross saponins of Tribulus terrestris,GSTT）是从蒺藜科植物蒺藜干燥成熟果实中提取的有效组分之一,是以甾体皂苷为主的总皂苷,主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷。研究表明,蒺藜皂苷具有降低血压、舒张血管、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、保护大鼠心肌缺血、保护大鼠脑缺血、改善微循环、抗衰老、降血糖和明目等作用。近年来,本实验室对蒺藜皂苷的药理作用及机制进行了研究,证实蒺藜皂苷对心脑缺血再灌注损伤均具有保护作用。但其确切的物质基础至今未明。与吉林大学化学学院合作,从蒺藜皂苷中分离提取出九种蒺藜皂苷单体,对其活性进行筛选,初步确定具有心肌保护作用的蒺藜皂苷单体（Tribulus terrestris saponin monomer,TTSM）,并对其作用机制进行了研究。本研究分为三个部分,先以总皂苷进行研究,确定最佳用药剂量,并以此做为单体研究中的阳性对照药。1、蒺藜皂苷对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用观察蒺藜皂苷（GSTT）对阿霉素（Adriamycin,ADR）诱导大鼠乳鼠心肌细胞损伤的保护作用,确定GSTT抗心肌缺血的有效剂量。分离出生13 d大鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为正常对照组、ADR（终浓度为2.0 mg·L-1）损伤组和GSTT 100、30、10 mg·L-1组,继续培养24 h后,应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养基中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）释放量,超氧化物歧化酶（SOD）活性,丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡及应用western blotting检测GSTT对Caspase-3的作用。结果表明,与对照组比较,ADR组心肌细胞存活数明显减少,心肌细胞培养液中CK、LDH、AST释放量增加（P<0.001）,同时SOD活力下降而MDA、NO含量升高（P<0.001）;与模型组比较,GSTT 100、30 mg·L-1组存活心肌细胞数增多（P<0.05,P<0.01）,心肌细胞培养液中CK、LDH、AST含量明显降低,SOD活力增加、MDA和NO含量降低（P<0.05,P<0.01）。流式细胞仪检测GSTT 100、30 mg·L-1组心肌细胞凋亡数明显减少,Caspase-3表达下降（P<0.01）。GSTT可对抗自由基,减轻ADR对心肌细胞的损伤,抑制心肌细胞凋亡,其中在剂量为100 mg·L-1时作用较为显著。2、蒺藜皂苷单体的活性筛选九种蒺藜皂苷单体,分别命名为JA, JB, JC, JD, JE, JF, JG, JH和JI。采用H2O2与心肌细胞培养5h,诱导心肌氧化应激损伤,以MTT法检测细胞存活率,筛选有心肌保护作用的单体。结果确定JB（替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖-（1→2）-[β-D-吡喃木糖-（1→3）] -β-D-吡喃葡萄糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）] -β-D-吡喃半乳糖苷,TTSMB）在剂量10-910-7mol·L-1具有活性,JG（海柯皂苷元3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-β-D -吡喃半乳糖苷）在10-910-6mol·L-1具有活性。JB易得,收率较高,因此以JB进行研究。3、蒺藜皂苷单体B对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用（1）蒺藜皂苷单体B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用70只大鼠随机分为7组,正常对照组（Control）、缺血/再灌注损伤组（I/R）、蒺蒺皂苷（GSTT）组、蒺蒺皂苷单体B（TTSMB）100、10、1 nmol?L-1组、Che+TTSMB+I/R组,缺血30 min,再灌120 min。采用TTC法测量心肌缺血面积,检测心脏灌流液中肌酸肌酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬酸氨基转移酶（AST）含量,心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）水平。心肌组织切片,镜下观察病理形态学变化,采用TUNEL染色计数心肌细胞凋亡率。Western blotting检测心肌组织中Bax及Bcl-2、Caspase-3、PKCε表达,免疫组织化学染色检测磷酸化PKCε表达。结果显示,TTSMB 100、10、1 nmol?L-1可缩小心肌梗死面积,减少心肌细胞中CK、LDH、AST的漏出,提高心肌组织SOD活性,降低MDA含量,减轻心肌组织的病理损害,降低心肌细胞凋亡率（P<0.01,P<0.001）。TTSMB能减少Bax、Caspase-3蛋白表达,增加Bcl-2、PKCε表达。应用PKC抑制剂Cherrythine可抑制TTSMB的心肌保护作用。（2）TTSMB对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用分离出生13 d大鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为正常对照组（Control）、缺氧复氧模型组（H/R）、蒺藜皂苷组（GSTT）、蒺藜皂苷单体（TTSMB ）10、1、0.1 nmol·L-1组,缺氧3 h,复氧2 h,体外模拟心肌缺血再灌注损伤。观察细胞形态学变化,应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养基中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）释放量,超氧化物歧化酶（SOD）活性,丙二醛（MDA）含量,并采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,应用western blotting检测Caspase-3表达。结果显示,与对照组比较,H/R组心肌细胞形态发生变化,存活细胞数明显减少,心肌细胞培养液中CK、LDH、AST释放量增加（P<0.01,P<0.001）,SOD活力下降,MDA含量升高（P<0.01,P<0.001）;与模型组比较,应用TTSMB后,存活心肌细胞数明显增多（P<0.05,P<0.01）,心肌细胞培养液中CK、LDH、AST含量降低,SOD活力增加、MDA含量降低（P<0.05,P<0.01）,心肌细胞凋亡率明显下降,Caspase-3表达亦下降。TTSMB可对抗自由基,减轻心肌细胞缺氧复氧损伤,抑制心肌细胞凋亡。（3）TTSMB抗缺氧复氧损伤的机制研究研究中发现TTSMB对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用,离体实验发现其能激活PKCε,为进一步检测TTSMB是否通过PKCε通路起到心肌保护作用,采用体外培养心肌细胞缺氧复氧损伤模型,并应用特异性PKCε抑制剂及ERK1/2抑制剂,检测单体B对PKCε及ERK1/2的作用,探讨其作用机制。分离出生13 d大鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为7组,正常对照组（Control）、缺氧复氧损伤组（H/R）、TTSMB 10 nmol?L-1组、PKCε抑制剂+TTSMB+H/R组、PD98059+TTSMB+H/R组、PKCε抑制剂+H/R组、PD98059+H/R组,缺氧3 h,复氧2 h。应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养基AST释放量、MDA含量,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡,激光共聚焦及免疫组织化学染色检测PKCε及ERK1/2表达,同时采用Western blotting检测心肌组织中PKCε及ERK1/2的表达。结果与模型组比较,应用PKCε特异性抑制剂后,ERK1/2表达下降,部分抵消了TTSMB的心肌细胞保护作用,而应用ERK1/2抑制剂对PKCε表达无明显影响。由此得出结论,TTSMB对心肌细胞的缺氧复氧损伤的保护作用与其激活PKCε/ERK1/2通路,从而启动心肌细胞保护作用有关。综上所述,单体B（化学名为替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖-（1→2）-[β-D-吡喃木糖-（1→3）] -β-D-吡喃葡萄糖基-（1→4）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→2）] -β-D-吡喃半乳糖苷,tribulosin）是蒺藜皂苷的有效成份之一,能对抗自由基损伤,抑制心肌细胞凋亡,对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能是通过激活PKCε/ERK1/2通路,从而抑制凋亡基因的表达而实现的。

论文目录

  • 前言
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 心肌缺血再灌注损伤的研究
  • 1.1.1 心肌细胞损伤的病理生理变化
  • 1.1.1.1 心肌代谢发生改变
  • 1.1.1.2 心肌缺氧引起的细胞损伤
  • 1.1.1.3 微血管受损和无复流现象
  • 1.1.1.4 心肌舒缩功能障碍
  • 1.1.1.5 缺血-再灌注心律失常
  • 1.1.2 心肌缺血再灌注损伤机制
  • 1.1.2.1 氧自由基与心肌缺血再灌注损伤
  • 1.1.2.2 钙超载与心肌缺血再灌注损伤
  • 1.1.2.3 白细胞浸润与心肌缺血再灌注损伤
  • 1.1.2.4 再灌注的速度和条件
  • 1.2 心肌细胞损伤的分子机制
  • 1.2.1 Fas
  • 1.2.2 Bcl-2 家族
  • 1.2.3 Caspase 家族
  • 1.2.4 PKC 家族
  • 1.2.5 MAPK 信号
  • 1.3 心肌缺血再灌注损伤的治疗
  • 1.3.1 抗氧化剂的作用
  • 1.3.2 抑制钙超载
  • 1.3.3 抑制炎症及免疫的药物
  • 1.3.4 增加心肌供血和供氧、改善心肌舒缩功能的药物
  • 1.3.5 心肌预适应
  • 1.3.6 心肌缺血的基因治疗
  • 1.4 蒺藜皂苷的研究现状及单体的开发
  • 1.5 本文的主要研究目的内容和意义
  • 第2章 蒺藜皂苷对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.1.1 药物与试剂
  • 2.1.1.2 动物
  • 2.1.1.3 仪器
  • 2.1.2 实验方法
  • 2.1.2.1 乳鼠心肌细胞的培养
  • 2.1.2.2 实验分组
  • 2.1.2.3 MTT 检测细胞存活率
  • 2.1.2.4 培养液中生化指标测定
  • 2.1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
  • 2.1.2.6 Western blotting 检测心肌细胞内Caspase-3 表达
  • 2.1.2.7 相关试剂的配制
  • 2.1.2.8 统计学分析
  • 2.1.3 实验结果
  • 2.1.3.1 GSTT 对阿霉素损伤心肌细胞形态的影响
  • 2.1.3.2 GSTT 对阿霉素损伤心肌细胞存活率的影响
  • 2.1.3.3 GSTT 对阿霉素损伤心肌细胞培养液中心肌酶的影响
  • 2.1.3.4 GSTT 对阿霉素损伤心肌细胞培养液中SOD、MDA、NO 的影响
  • 2.1.3.5 GSTT 对阿霉素损伤心肌细胞凋亡率的影响
  • 2.1.3.6 GSTT 对阿霉素损伤心肌细胞Caspase-3 的影响
  • 2.1.4 小结
  • 第3章 蒺藜皂苷单体活性筛选
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.1.1 药物与试剂
  • 3.1.1.2 动物
  • 3.1.1.3 仪器
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.1.2.1 乳鼠心肌细胞的培养
  • 3.1.2.2 实验分组
  • 3.1.2.3 细胞存活率测定
  • 3.1.2.4 统计分析
  • 3.1.3 结果
  • 第4章 蒺藜皂苷单体B 对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用研究
  • 4.1 蒺藜皂苷单体B 对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.1.1 药品与试剂
  • 4.1.1.2 动物
  • 4.1.1.3 主要仪器
  • 4.1.2 实验方法
  • 4.1.2.1 大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型的建立
  • 4.1.2.2 实验分组
  • 4.1.2.3 冠脉流出液CK、AST、LDH 含量的检测
  • 4.1.2.4 心肌组织SOD、MDA 含量的测定
  • 4.1.2.5 心肌组织TTC 染色观察心肌梗死面积
  • 4.1.2.6 病理形态学观察
  • 4.1.2.7 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡
  • 4.1.2.8 免疫组织化学检测心肌组织PKCε表达
  • 4.1.2.9 Western blotting 检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、PKCε表达
  • 4.1.2.10 统计学分析
  • 4.1.3 结果
  • 4.1.3.1 TTSMB 对冠脉流出液中心肌酶的影响
  • 4.1.3.2 TTSMB 对SOD、MDA 含量的影响
  • 4.1.3.3 TTSMB 对心肌梗死面积的影响
  • 4.1.3.4 TTSMB 对缺血再灌注心肌组织病理形态的影响
  • 4.1.3.5 TTSMB 对心肌细胞凋亡的影响
  • 4.1.3.6 TTSMB 对心肌组织Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的影响
  • 4.1.3.7 TTSMB 对心肌细胞PKCε表达的影响
  • 4.1.3.8 TTSMB 对心肌组织磷酸化PKCε表达的影响
  • 4.1.4 小结
  • 4.2 蒺藜皂苷单体B 对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用
  • 4.2.1 实验材料
  • 4.2.1.1 药品与试剂
  • 4.2.1.2 动物
  • 4.2.1.3 主要仪器
  • 4.2.2 实验方法
  • 4.2.2.1 乳鼠心肌细胞培养
  • 4.2.2.2 实验分组
  • 4.2.2.3 心肌细胞形态学变化
  • 4.2.2.4 MTT 检测细胞存活率
  • 4.2.2.5 培养液中生化指标测定
  • 4.2.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡
  • 4.2.2.7 Western blotting 检测Caspase-3 表达
  • 4.2.2.8 统计学分析
  • 4.2.3 实验结果
  • 4.2.3.1 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞形态的影响
  • 4.2.3.2 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞存活率的影响
  • 4.2.3.3 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞培养液中心肌酶的影响
  • 4.2.3.4 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞培养液中SOD、MDA 的影响
  • 4.2.3.5 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞凋亡率的影响
  • 4.2.3.6 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞Caspase-3 的影响
  • 4.2.4 小结
  • 4.3 TTSMB 抗缺氧复氧损伤的机制研究
  • 4.3.1 材料与方法
  • 4.3.1.1 药物、试剂
  • 4.3.1.2 动物
  • 4.3.1.3 仪器
  • 4.3.2 实验方法
  • 4.3.2.1 乳鼠心肌细胞的培养
  • 4.3.2.2 实验分组
  • 4.3.2.3 MTT 法检测细胞存活率
  • 4.3.2.4 培养液中生化指标测定
  • 4.3.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
  • 4.3.2.6 免疫组织化学检测ERK1/2 转位
  • 4.3.2.7 激光共聚焦显微镜检测PKCε表达
  • 4.3.2.8 Western blotting 检测细胞内PKCε、ERK1/2 表达
  • 4.3.2.9 统计学分析
  • 4.3.3 实验结果
  • 4.3.3.1 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞存活率的影响
  • 4.3.3.2 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞培养液中AST、MDA 的影响
  • 4.3.3.3 TTSMB 对缺氧复氧损伤心肌细胞凋亡率的影响
  • 4.3.3.4 TTSMB 对PKCε表达的影响
  • 4.3.3.5 TTSMB 对ERK1/2 核转位的影响
  • 4.3.3.6 Western blot 检测 PKCε和ERK1/2 表达
  • 4.3.4 小结
  • 第5章 讨论
  • 第6章 结论
  • 参考文献
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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