论文摘要
目的:本实验旨用不同浓度雷公藤内脂醇对人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株（COC1/DDP）进行干预,观察其对体外培养的COC1/DDP活性的影响及作用时间和量效关系。以期寻找对耐顺铂治疗的上皮性卵巢癌病人的有效治疗药物。方法:1 COC1/DDP细胞的传代培养:COC1/DDP细胞用COC1/DDP完全培养基培养,将细胞密度调整至5×105/ml ,置培养瓶中,在37℃、5%CO2,饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养。每23天细胞长满后,吹打后制成单细胞悬液,离心1000r/min 10min,弃上清液,更换COC1/DDP完全培养基,按5×105/ml密度补充液体容量至7ml接种到培养瓶内。2 COC1/DDP细胞的生长曲线测定:取对数生长期细胞5×105/ml置于24孔板中,在37℃、5%CO2,饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养5d,每天取三孔细胞,以台盼蓝法计算单位活细胞数量,并取平均值。以细胞密度为纵轴,以时间为横轴绘制COC1/DDP细胞生长曲线图。通过生长曲线,可以显示COC1/DDP细胞的生长周期,确定最佳干预时间。3雷公藤内脂醇对COC1/DDP细胞增殖的影响:雷公藤内脂醇作用组用不同浓度雷公藤内脂醇（1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml）干预,分为8个浓度雷公藤内脂醇作用组;空白对照组用COC1/DDP细胞完全培养基干预,分别作用COC1/DDP细胞24h、48h、72h,之后用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测每孔光吸收值（OD值）的大小可反映细胞的数量及活性,OD值越高则细胞活性越强。结果可反映雷公藤内脂醇对COC1/DDP细胞增殖的影响,同时计算细胞抑制率及IC50值（IC50值即细胞存活率为≤50%时的药物浓度,表示药物的细胞毒性）。4雷公藤内脂醇对COC1/DDP细胞形态及超微结构的改变:通过倒置显微镜及透射电子显微镜下观察了空白对照组（COC1/DDP细胞专用培养基）、低浓度雷公藤组（3ng/ml）与高浓度雷公藤组（50ng/ml）作用48h后,COC1/DDP细胞的细胞形态及超微结构的改变。结果:1体外培养的COC1/DDP细胞的生长曲线:观察COC1/DDP细胞的生长曲线,第1、2、3天,细胞增殖活跃,第三天后细胞增殖进入平台期,之后因生长空间限制而导致细胞密度过大及营养相对缺乏的原因,细胞量缓慢减少。2雷公藤内酯醇对COC1/DDP细胞增殖的影响:结果可见雷公藤内酯醇对COC1/DDP细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性。从3ng/ml到100 ng/ml的雷公藤内酯醇均可明显抑制COC1/DDP细胞的生长增殖,其药物作用48h后的IC50为药51.76ng/ml,药物作用72h后的IC50为10.78ng/ml。3雷公藤内脂醇对COC1/DDP细胞形态及超微结构的影响:3.1雷公藤内脂醇作用后COC1/DDP细胞形态的改变:通过倒置显微镜可见空白对照组COC1/DDP细胞生长良好;低浓度雷公藤内脂醇组COC1/DDP细胞分裂状及成串细胞团减少,细胞变扁平,透光性减少,细胞数量较空白对照组减少;高浓度雷公藤内脂醇组COC1/DDP细胞细胞形态多样化,胞浆内颗粒增多,COC1/DDP细胞数量及细胞密度较低浓度雷公藤内脂醇组更为减少3.2雷公藤内脂醇作用后COC1/DDP细胞超微结构的改变:3.2.1空白对照组通过透射电子显微镜观察COC1/DDP细胞形态及超微结构的改变,可见空白对照组COC1/DDP呈椭圆形,细胞核为卵圆形,染色质丰富;3.2.2低浓度雷公藤内脂醇组可见部分COC1/DDP细胞体积较大,呈多角形,细胞膜微绒毛较空白对照组细胞明显减少,细胞核较空白对照组变大、内有包含物,染色质聚集、固缩、碎裂、溶解,核膜内陷,细胞质内有空泡形成,线粒体的数目及形状改变,高尔基体碎裂等细胞衰老改变;3.2.3高浓度雷公藤内脂醇组COC1/DDP细胞膜完整,细胞膜表面微绒毛消失,细胞器较空白对照组增多,如线粒体增多,内质网扩张,有些细胞膜皱缩,胞质浓缩,核团聚。多数细胞可见细胞核染色质聚集成团块状、新月状,并凝聚在核膜周边。有调亡小体生成的典型细胞凋亡改变呈现。结论:1雷公藤内脂醇对体外培养的COC1/DDP细胞有明显的抑制作用,其浓度自3ng/ml开始有明显抑制作用,并与时间及药物浓度依赖性,药物作用48h后的IC50为药51.76ng/ml,药物作用72h后的IC50为10.78ng/ml。2低浓度及高浓度雷公藤内脂醇对COC1/DDP细胞均有明显抑制作用,其抑制作用的机制可能与其诱导COC1/DDP细胞衰老及细胞凋亡有关。3本研究以COC1/DDP为体外实验模型,发现雷公藤内脂醇对COC1/DDP细胞有明显的抑制作用,为寻找耐顺铂卵巢癌的有效治疗药物提供了信息,为雷公藤内脂醇成为耐顺铂卵巢癌的有效治疗药物提供了体外实验基础。
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