用植物表达轮状病毒VP6亚单位食用疫苗的研究

论文摘要

将轮状病毒（Rotavirus）VP6亚单位基因插入原核表达载体pGEX-KG中,获得了重组质粒pGEX-VP6。经IPTG诱导,在大肠杆菌中高水平表达了GST（谷胱苷肽转移酶）与VP6的融合蛋白。通过GST亲和层析、凝血酶切割和凝胶过滤纯化,获得了高纯度的VP6蛋白。免疫家兔,制备了VP6的高效价特异性多克隆兔抗血清。 以甜菜黑色焦枯病毒（BBSV）侵染性克隆为基础,用经植物偏好型密码子修饰的VP6基因（sVP6）替代BBSV的外壳蛋白（CP）基因。其体外转录产物用于机械接种BBSV的枯斑寄主苋色藜。接种后4-10天,提取发病叶片的总RNA及蛋白,利用RT-PCR或Western blotting方法对sVP6的RNA转录和蛋白表达情况进行检测。在此基础上,利用间接ELISA的方法对不同批次接种叶片中VP6蛋白的表达量进行了测定,数据统计结果表明,发病苋色藜叶片中,VP6蛋白的含量平均值可达植物总可溶性蛋白的0.25%。 分别采集苋色藜健康叶片和接种表达VP6的叶片,粗提取并浓缩叶片中总可溶性蛋白,辅以CpG免疫佐剂灌胃免疫6-8周龄的BALB/c母鼠。初免后的7周中,对小鼠的唾液、粪便及肠道粘膜IgA及血清IgG进行了间接或双抗夹心ELISA的检测。结果表明,与对照组小鼠相比,处理组小鼠无论粘膜IgA还是体液IgG均显示出明显的抗体发生趋势。 用猿轮状病毒SA-11株对受免母鼠所产乳鼠进行攻毒实验,结果表明,在相同的攻毒剂量下,与对照组相比,免疫组母鼠所产小鼠在攻毒后几天中致病率明显下降,腹泻症状较轻且症状持续时间相对缩短。这些研究结果表明,被免疫母鼠体内由VP6亚单位植物食用疫苗所产生的非中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供异源交叉保护。 同时,成功构建了含轮状病毒VP6亚单位基因的植物双元表达载体pBVP6和pBinBB-sVP6。以分别含有这两种表达载体的农杆菌EHA101进行了甜菜转化,并对甜菜再生苗的外源基因整合情况进行了PCR、PCR-Southern和Southern blotting分析。 以上结果为利用植物作为生物反应器,通过稳定表达或瞬时表达方式生产轮状病毒的可食用疫苗提供了新的技术途径和材料基础。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 轮状病毒及其疫苗的研究进展
• 1.1.1 轮状病毒概述
• 1.1.2 轮状病毒疫苗的研究进展
• 1.2 植物基因工程疫苗
• 1.2.1 植物基因工程疫苗及食用疫苗概述
• 1.2.2 植物基因工程疫苗的作用原理及获得方法
• 1.2.3 植物基因工程疫苗的优势和局限性
• 1.2.4 植物基因工程疫苗的研究进展
• 1.3 甜菜再生及转化研究概况
• 1.4 甜菜黑色焦枯病毒的研究进展
• 1.4.1 甜菜黑色焦枯病毒概述
• 1.4.2 甜菜黑色焦枯病毒作为载体在植物中表达外源蛋白的潜力
• 1.5 研究的目的和意义
• 第二章 材料及方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 质粒载体
• 2.1.4 酶和化学试剂
• 2.1.5 引物设计
• 2.1.6 培养基和缓冲液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.3 单菌落直接鉴定法（Cracking）快速筛选重组质粒
• 2.2.4 菌落PCR
• 2.2.5 质粒DNA的小量提取
• 2.2.6 质粒DNA的大量提取
• 2.2.7 DNA片段的回收纯化
• 2.2.8 目的片段与载体的连接
• 2.2.9 质粒载体的酶切和脱盐处理
• 2.2.10 体外转录
• 2.2.11 RNA摩擦接种
• 2.2.12 植物总RNA的提取
• 2.2.13 反转录PCR（RT-PCR）
• 2.2.14 Western blotting
• 2.2.15 大肠杆菌原核表达载体的诱导表达
• 2.2.16 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色
• 2.2.17 融合蛋白的可溶性分析
• 2.2.18 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.19 植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.20 甜菜基因组总DNA的提取
• 2.2.21 基因组PCR
• 2.2.22 Southern blotting（同位素标记法）
• 2.2.23 PCR-Southern
• 第三章 轮状病毒VP6亚单位在大肠杆菌中的诱导表达、纯化及其高效抗血清的制备
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 诱导表达及可溶性分析
• 3.2.2 VP6蛋白的纯化
• 3.2.3 VP6抗血清的制备
• 3.3 讨论
• 3.3.1 原核表达体系的选取
• 3.3.2 纯化方法的选取
• 3.3.3 兔抗血清制备方法的改进
• 第四章 以甜菜黑色焦枯病毒为载体瞬时表达轮状病毒VP6亚单位抗原
• 4.1 材料及方法
• 4.1.1 ELISA缓冲液的配制
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 瞬时表达载体pBBSV-sVP6的构建
• 4.2.2 体外转录和摩擦接种
• 4.2.3 发病症状观察
• 4.2.4 sVP6基因在苋色藜中表达的分子检测
• 4.3 讨论
• 第五章 表达VP6的植物叶片饲喂小鼠诱导抗体产生及其免疫保护作用
• 5.1 材料及方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 植物接种及叶片收集
• 5.2.2 植物材料总可溶性蛋白的提取及定量分析
• 5.2.3 小鼠免疫及其体内保护抗体的检测
• 5.2.4 攻毒及该食用疫苗为小鼠提供抵抗其他A组轮状病毒的异源交叉保护
• 5.3 讨论
• 5.3.1 粘膜免疫的可行性及意义
• 5.3.2 轮状病毒VP6亚单位可食用疫苗诱导的被动免疫
• 5.3.3 可食用疫苗存在的问题及免疫佐剂
• 第六章 农杆菌介导的VP6基因甜菜转化体系的建立
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 甜菜的转化方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 植物表达载体pBinBB-sVP6的构建
• 6.2.2 农杆菌介导的甜菜遗传转化
• 6.2.3 甜菜再生苗VP6基因整合的分子检测
• 6.3 讨论
• 6.3.1 甜菜品种对遗传转化的影响
• 6.3.2 转化方法对甜菜遗传转化的影响
• 6.3.3 再生抗性植株的生根
• 参考文献
• 致谢
• 附录Ⅰ 调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）
• 附录Ⅱ TRIS-甘氨酸SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表
• 附录Ⅲ 缩略词
• 作者简介