棉花根际拮抗菌的筛选、鉴定及枯草芽孢杆菌MH25 Iturin A操纵子克隆

论文摘要

从金乡、济宁农科院农田中采集13个棉花根际土壤样品,通过平板培养法,获得1277个细菌分离物。以立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）为指示菌,采用平板对峙法初筛获得对棉花立枯病具有拮抗作用的25个细菌分离物,其中MH1和MH25对棉花立枯病抑制效果明显,具有作为生防制剂的潜力。通过形态观察、生理生化测定和16S rDNA测序分析,将MH1鉴定为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）,MH25鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。根据已报导的芽孢杆菌非核糖体合成抗生素的操纵子保守序列,设计兼并性引物TGD（5’-TWYCGIACIGGIGAYYKIGKICG-3’）和LGG（5’-AWIGARKSICCICCISSRIMRAARAA-3’）。通过PCR扩增,得到818bp的DNA片断。将序列测定结果在NCBI上进行BLAST,选择同源性较高的Bacillus subtilis RB14的IturinA操纵子序列、Bacillus subtilis AU195的Bacillomycin D操纵子序列、Bacillus subtilis ATCC6633的Mycosubtin操纵子序列,分析其同源序列,分别设计14对和6对引物,相邻片断之间有不同长度的重叠序列。扩增之后,选择适当大小的PCR产物,连接载体进行测序,在NCBI中比对,确定是与抗生素相关的序列之后,根据重叠序列将其拼接,最终获得了38845bp长度的DNA片断。利用DNAman软件,对获得的片断进行分析,初步结果该片断含有四个ORF,将其四个ORF分别与Bacillus subtilis RB14的IturinA操纵子序列的四个对应ORF序列进行比对,发现ORF1与ituD相似性为99%, ORF2与ituA相似性为98.70%, ORF3与ituB相似性为98.99%, ORF4与ituC相似性为99.48%,每个ORF中又含有不同功能的结构域,在ORF1上游序列中,发现有TATACACA-16bp-TAGGAT序列,推测其可能是该操纵子的启动子,但是其与σA-10和-35（TTGACA-17bp-TATAAAT）有差别。采用同源重组的方法,敲除Bacillus subtilis MH25 ituB基因的色氨酸腺苷酸化区域。首先以Bacillus subtilis MH25基因组DNA为模板,PCR扩增出Tyr区域的DNA片断,将其连接到载体pMD18-T,构建质粒pMDT,然后用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ分别对质粒pMDT和pBRMCS-5双酶切,连接构建了重组质粒pBRMT,最后用PstⅠ分别对质粒pBRMT和pUC4K单酶切,构建了重组质粒pBRMTK。再以重组质粒pBRMTK为模板,PCR扩增tyr::Km片断,通过原生质体转化,将其转入Bacillus subtilis MH25中,在30μg/mL卡那霉素的抗性CMR平板上,筛选重组子,但是未筛选到重组子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 棉花病害
• 1.2 植物病害的防治
• 1.2.1 化学农药防治
• 1.2.2 生物防治
• 1.3 微生物在植物病害防治中的应用
• 1.3.1 生防细菌
• 1.3.2 生防放线菌
• 1.3.3 生防真菌
• 1.4 拮抗菌的生防机理
• 1.4.1 抗生作用
• 1.4.2 重寄生作用
• 1.4.3 空间和营养竞争
• 1.4.4 诱导植物系统抗性
• 1.5 本研究的目的意义
• 1.6 研究内容、技术路线及方法
• 第二章 棉花根际立枯病拮抗菌的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 样品
• 2.2.2 病原菌菌种
• 2.2.3 主要药品、试剂
• 2.2.4 仪器及器皿
• 2.2.5 培养基
• 2.2.6 样品采集
• 2.2.7 细菌的分离
• 2.2.8 拮抗细菌的筛选
• 2.2.9 拮抗细菌的保存
• 2.3 结果
• 2.3.1 细菌的分离纯化
• 2.3.2 拮抗细菌的筛选
• 2.4 讨论
• 第三章 棉花根际立枯病拮抗菌MH1 和MH25 的鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 主要药品、试剂
• 3.2.4 培养基及培养液
• 3.2.5 MH1 和MH25 的形态及生理生化测定
• 3.2.6 DNA 提取
• 3.2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.8 PCR 扩增16S rDNA 序列
• 3.2.9 PCR 产物的纯化
• 3.2.10 DNA 浓度的确定
• 3.2.11 16S rDNA 序列测定及分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 MH1 和MH25 的形态特征
• 3.3.2 生理生化特征
• 3.3.3 16S rDNA 序列的扩增
• 3.3.4 序列测定、分析及系统发育树的构建
• 3.4 讨论
• 第四章 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） MH25 Iturin A 操纵子的克隆与分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 主要药品、试剂
• 4.2.4 培养基与培养液
• 4.2.5 引物的设计合成
• 4.2.6 PCR 扩增
• 4.2.7 DNA 凝胶回收
• 4.2.8 外源片断克隆到pMD18-T
• 2 法）'>4.2.9 E. coli DH5α感受态细胞制备（CaCl₂法）
• 4.2.10 质粒大小快速检测
• 4.2.11 碱裂解法小量提取质粒
• 4.2.12 相应引物PCR 扩增检测
• 4.2.13 序列测定及拼接
• 4.2.14 序列的初步分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 枯草芽孢杆菌MH25 非核糖体肽操纵子保守序列的克隆
• 4.3.2 保守性片断M1 左端序列的克隆
• 4.3.3 保守性片断M1 右端序列的克隆
• 4.3.4 序列拼接及初步分析
• 4.4 讨论
• 第五章 枯草芽孢杆菌MH25 ituB 基因的Tyr 功能域敲除
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株及质粒
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 主要药品、试剂
• 5.2.4 培养基及培养液
• 5.2.5 抗药性试验
• 5.2.6 Bacillus subtilis MH25 基因组DNA 提取
• 5.2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 5.2.8 DNA 的凝胶回收
• 5.2.9 DNA 浓度的确定
• 2法）及转化'>5.2.10 DH5α感受态细胞制备（CaCl₂法）及转化
• 5.2.11 质粒的小规模提取
• 5.2.12 Tyr 区域的PCR 扩增
• 5.2.13 重组质粒pMDT 的构建
• 5.2.14 重组质粒pMDT PCR 的验证
• 5.2.15 重组质粒pBRMT 的构建
• 5.2.16 重组质粒pBRMT 的验证
• 5.2.17 卡那霉素抗性基因的获得及重组质粒pBRMTK 的构建
• 5.2.18 重组质粒pBRMTK 的验证
• 5.2.19 PCR 扩增重组质粒pBRMTK 上的tyr：：Km
• 5.2.20 Bacillus subtilis MH25 原生质体的制备与转化
• 5.2.21 重组子的验证
• 5.3 结果
• 5.3.1 Bacillus subtilis MH25 的抗药性试验
• 5.3.2 Tyr 区域的敲除策略
• 5.3.3 Tyr 区域 DNA 序列的PCR 扩增及重组质粒pMDT 的构建
• 5.3.4 重组质粒pBRMT 的构建
• 5.3.5 重组质粒pBRMTK 的构建
• 5.3.6 Bacillus subtilis MH25 菌株的原生质体形成率及再生率
• 5.3.7 Bacillus subtilis MH25 Tyr 区域DNA 片断的敲除及重组子筛选
• 5.4 讨论
• 第六章 结论及建议
• 6.1 结论
• 6.2 尚待完成的工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况