SP-TAT-VP3融合基因表达对肝癌治疗作用的实验研究

论文摘要

近年来,随着分子生物学研究的进展和对肿瘤发病分子机制认识的深入,通过将人的正常基因或有治疗作用的基因以一定的方式导入人体靶细胞的肿瘤基因治疗手段开始进入临床。基因治疗针对的是疾病的根源——异常的基因本身,其理论基础和强大生命力显而易见,因此具有重大的医用价值和巨大的社会价值。肝癌被称为“癌中之王”,是肝胆外科最常见的恶性肿瘤。全世界半数左右的患者集中在我国,每年约有11万人死于肝癌,主要是由于适用于手术切除的病例很少。对于不能手术切除的肝癌,其非手术疗法首选经肝血管化疗栓塞和超声引导经皮穿刺瘤内无水酒精注射,但目前的疗效并不令人满意。上述基因治疗方法可望为肝癌的治疗提供一条新途径。VP3是一种来源于鸡贫血病毒的小蛋白,能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡,而对正常细胞无凋亡诱导作用。VP3的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关,在转化或肿瘤细胞中VP3定位于细胞核,而在正常细胞中定位于细胞质。VP3的磷酸化决定其核定位,在肿瘤细胞中VP3被磷酸化,磷酸化的VP3进入细胞核,并诱导细胞凋亡。VP3诱导的细胞凋亡不依赖p53,不为Bcl-2、Bcl-xL的过表达所抑制,但VP3诱导的快速凋亡效应需要caspase3的活化。VP3具有很强的形成聚合体的倾向,在细胞内表达的VP3以多聚体形式存在,但多聚体的形成和解聚并不是其诱导凋亡所必需的。VP3此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景。HIV-TAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体—蛋白质转导结构（proteintransductⅠ-on domains,PTDs）或称细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。HIV-TAT能穿透细胞膜、细胞核膜,携带肽、蛋白质和DNA分子等进入胞质和胞核发挥生物效应,具有高效性、无须耗能或通过受体转运的特点,为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、简便的方法。目前的体内及体外试验显示HIV-TAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞,且未观察到明显毒副作用。本研究是探寻有效的、安全的和特异的治疗恶性肿瘤的生物学方法。我们选用了鸡贫血病毒的VP3蛋白作为治疗肿瘤的特异分子,使用信号肽序列来实现非肿瘤细胞转导后的长期持续分泌表达。采用TAT-VP3融合表达方式,保证治疗分子可以进入未转染的残余肿瘤细胞和已经转移的肿瘤细胞,并确保治疗分子导入肿瘤细胞核内的靶部位。通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。在研究过程中,我们以人肝癌HepG2细胞作为研究对象。通过DNA重组技术,用pCDNA3.1/VP3质粒为模板,构建SP-TAT-VP3融合基因plenti6-V5-D-TOPO?载体。然后用MTT法、Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡活性和细胞周期,并制作动物模型系统研究重组SP-TAT-VP3对HepG2细胞及动物模型的治疗作用。本实验主要结果及结论为:1.成功构建了稳定表达SP-TAT-VP3融合基因的真核表达载体。2.SP-TAT-VP3融合基因的表达可有效的抑制人肝癌HepG2细胞的生长。3.体外实验表明SP-TAT无明显的细胞毒性。4.成功证明SP-TAT-VP3融合基因转染后可有效的分泌至细胞外,并通过旁观者效应起作用。5.体内实验结果表明,SP-TAT-VP3融合基因的表达可以降低人肝癌HepG2细胞的体内成瘤能力,瘤体缩小。因此,SP-TAT-VP3融合基因的表达,能引起肿瘤细胞增殖活性降低、细胞凋亡,并引起细胞周期G1期阻滞,有望成为一种新的肿瘤辅助治疗方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 肿瘤的基因治疗
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 肿瘤基因治疗常用策略
• 1.1.3 小结
• 1.2 VP3
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 VP3与鸡贫血病毒
• 1.2.3 VP3诱导的肿瘤细胞凋亡
• 1.3 蛋白转导域研究进展
• 1.3.1 蛋白转导域与HIV-TAT蛋白转导结构域
• 1.3.2 蛋白转导域的作用机制
• 1.3.3 TAT-PTD转导的优越性
• 1.3.4 PTD融合分子的制备
• 1.3.5 PTD在医学中的应用
• 1.3.6 问题与展望
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 实验材料
• 2.1 质粒和菌种
• 2.2 细胞系
• 2.3 实验动物
• 2.4 主要试剂
• 2.5 主要溶液配制和使用仪器
• 3 SP-TAT-VP3融合基因真核表达载体的构建
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 SP-TAT-VP3融合基因PCR引物的设计与合成
• 3.1.2 SP-TAT-VP3融合基因与plenti6-V5-D-TOPO（?）表达载体的连接及筛选鉴定
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 SP-TAT-VP3融合基因PCR引物的设计与合成
• 3.2.2 SP-TAT-VP3融合基因的合成和真核表达载体的构建
• 3.3 讨论
• 4 SP-TAT-VP3融合基因的表达对HepG2细胞生物学特性的影响
• 4.1 实验方法
• 4.1.1 细胞培养
• 4.1.2 Blasticidin霉素筛选浓度的确定
• 4.1.3 脂质体介导基因转染
• 4.1.4 单克隆细胞株的筛选
• 4.1.5 瞬时转染与共培养
• 4.1.6 RT—PCR检测SP-TAT-VP3融合基因的RNA表达水平
• 4.1.7 Western blot检测SP-TAT-VP3融合基因蛋白表达水平
• 4.1.8 免疫荧光细胞化学的间接染色方法检测SP-TAT-VP3融合基因蛋白表达
• 4.1.9 细胞增殖活性的检测
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 SP-TAT-VP3融合基因表达载体转染后HepG2细胞体外增殖能力明显下降
• 4.2.2 Blasticidin霉素筛选浓度确定和筛选稳定表达SP-TAT-VP3融合基因的单克隆细胞
• 4.2.3 SP-TAT-VP3融合蛋白的分泌表达及TAT-VP3对HepG2细胞的生长抑制作用
• 4.2.4 共培养后的HepG2细胞可观察到细胞周期G1期阻滞
• 4.2.5 SP-TAT的毒性检测
• 4.3 讨论
• 5 SP-TAT-VP3融合基因的表达对裸鼠移植瘤的抑制作用
• 5.1 实验方法
• 5.1.1 裸鼠成瘤实验
• 5.1.2 制备形态学标本
• 5.1.3 免疫组织化学反应
• 5.2 实验结果
• 5.3 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间的成果
• 致谢