新疆酸驼乳中乳酸菌分离鉴定及其细菌素研究

论文摘要

本研究对新疆哈萨克族牧民传统发酵酸驼乳中的乳酸菌进行分离鉴定,对部分菌株进行了16SrDNA序列及系统发育分析,同时对酸驼乳中产细菌素乳酸菌进行筛选,并对乳酸菌细菌素进行抑菌性及提取纯化研究,试验结果如下：1.从新疆玛纳斯、乌拉泊、南山、水西沟（分别简写为MLS、WLB、NSL、SXG）采集的4份酸驼乳中,分离出乳酸菌23株。经传统形态学及生理生化鉴定,结果为乳杆菌属（Lactobacillus）17株（73.91%）,分别为瑞士乳杆菌（L. helveticus）、干酪乳杆菌（L. casei）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、德氏乳杆菌乳亚种（L. delbrueckii subsp. lactis）、植物乳杆菌（L. plantarum）、发酵乳杆菌（L. fermentum）、副干酪乳杆菌（L. paracasei）;乳球菌属（Lactococcus）3株（13.04%）,为乳酸乳球菌乳酸亚种（L. lactis subsp.lactis）;肠球菌属（Enterococcus）2株（8.70%）,为坚强肠球菌（E. durans）;链球菌属（Streptococcus） 1株（4.35%）,为唾液链球菌（S. salivarius）。优势杆菌为L. helveticus （17.39%）,优势球菌为L. lactis subsp. lactis （13.04%）。2.从上述23株菌中选取10株代表菌株NSL2、MLS5、SXG1、NSL4、WLB3、MLS2、MLS6、WLB5、SXG5、NSL7进行16S rDNA序列分析,代表菌株与NCBI数据库中比对菌株的相似度均大于96%,具有较高的相似度,其中菌株M1S5与L. casei的平均相似度为99%,菌株鉴定结果与传统生理生化鉴定结果保持一致。3.根据16S rDNA序列系统发育分析，判定菌株MIS5与L.casei CGMCC1.2435（HM162414）、BL23 （HM162415）、NM89-3 （HM218375）的分支遗传距离最近,且为同一支系,其可信度达到96%；菌株L. casei MIS5、L. paracasei MLS6、L. helveticus NSL2、L. rhamnosus SXG1、L. plantarum WLB3、L. fermentum MLS2、L. delbrueckii subsp. Lactis NSL4为一大支系,菌株E. durans SXG5为一支系,菌株S. salivarius WLB5、L. lactis subsp. Lactis NSL7为另一支系。4.通过双层琼脂扩散打孔法,从已分离的23株乳酸菌中,筛选出9株对金黄色葡萄球菌（Saureus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和大肠杆菌（E coli）具有抑菌活性的菌株,其中干酪乳杆菌MLS5抑菌活性最强。以S. aureus为指示菌,通过有机酸、过氧化氢抑菌排除和蛋白酶敏感性试验,确定MLS5产生的抑菌物质为蟹白质类细菌素。温度和pH耐受试验表明,该细菌素具有良好的热稳定性（121℃,20mmin）,pH3-6具有抑菌活性。抑菌谱试验表明,该细菌素不仅能抑制革兰氏阳性细菌,对大肠杆菌和毛霉菌也有抑制作用,具有广谱的抑菌性。菌株MLS5的发酵曲线表明,菌株在37℃培养条件下具有良好的产细菌素和产酸能力,该细菌素在菌体生长对数中期产生,在生长稳定期抑菌活性达到最大。5.以MRS液体培养基中37℃静置培养22h为发酵条件,对菌株MLS5细菌素进行提取纯化。结果表明,菌株MLS5发酵上清液经饱和度为50%硫酸铵盐析及732-阳离子交换树脂层析,最后细菌素得率为15.14%,比活力为1854.27IU/mg,是发酵上清液的31.96倍。细菌素纯化后经SDS-PAGE电泳出现清晰条带,分子量在14.4kDa-20kDa之间。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 酸驼乳的起源和研究现状
• 1.1.1 酸驼乳的制作方法
• 1.1.2 驼乳及酸驼乳的营养价值与医疗作用
• 1.2 乳酸菌的研究概况
• 1.2.1 乳酸菌的分类研究
• 1.2.2 16S rRNA基因序列分析在乳酸菌分类鉴定中的应用
• 1.2.3 乳酸菌的生理功能
• 1.3 乳酸菌细菌素综述
• 1.3.1 乳酸菌细菌素的定义与分类
• 1.3.2 乳酸菌细菌素的抑菌谱及抑菌机理
• 1.3.3 乳酸菌细菌素的理化性质
• 1.3.4 乳酸菌细菌素的提取纯化
• 1.3.5 乳酸菌细菌素的应用
• 1.4 课题研究的目的和意义
• 1.5 课题研究的主要内容
• 第2章 酸驼乳中乳酸菌的分离鉴定及16S rDNA分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 乳酸菌分离株的菌落形态及细胞形态特征
• 2.2.2 乳酸菌分离株生理生化鉴定结果
• 2.2.3 16S rDNA分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 酸驼乳中乳酸菌细菌素的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 产细菌素乳酸菌的筛选结果
• 3.2.2 细菌素蛋白质性质的确定结果
• 3.2.3 细菌素粗提物对温度和pH的耐受性试验结果
• 3.2.4 抑菌谱的测定
• 3.2.5 菌株MLS5的发酵曲线结果
• 3.2.6 细菌素的纯化结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 抑菌活性的检测
• 3.3.2 细菌素蛋白质性质的确定
• 3.3.3 细菌素的耐受性
• 3.3.4 抑菌谱
• 3.3.5 菌株MLS5的发酵曲线
• 3.3.6 细菌素的提取纯化
• 3.4 小结
• 3.4.1 产细菌素乳酸菌的筛选及其抑菌性研究
• 3.4.2 细菌素的提取纯化
• 第4章 结论
• 4.1 结论
• 4.2 有待进一步研究的问题
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介