茶树主要品质性状关键基因的反义基因遗传转化及表达研究

论文题目: 茶树主要品质性状关键基因的反义基因遗传转化及表达研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 茶学

作者: 吴颖

导师: 梁月荣

关键词: 茶树,基因,基因,反义技术,发根农杆菌,转化,儿茶素类

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 茶树(Camellia sinensis(L.)O Kuntze)是我国重要的一种经济作物。随着我国现代社会需求的迅猛发展,茶树优良品种的培育与推广也在进一步加快,传统的育种方法因为周期长已经不能满足社会对茶产品的需要;当前分子生物学,尤其转基因技术已趋成熟,因此被广泛运用到包括茶树在内的植物育种工作中。咖啡因是一种兴奋剂,过量摄入可以便人产生心悸、胃肠失调、焦虑、震颤、血压升高和失眠等等症状。随着人民生活条件的好转,对健康的关注,低咖啡因茶产品开发就受到了瞩目。由于传统手段的种种不足,我们使用基因工程技术,通过调控咖啡因合成途径中的关键酶来培育新的育种材料。经研究发现:S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶和茶树咖啡因合成酶(TCS)基因是茶树中的咖啡因生物合成途径中关键的基因,对咖啡因的生物合成有重要作用。本论文使用RT-PCR扩增SAM合成基因片断,并对其进行酶切、连接,把它连接到质粒pCAMBIA1301上,构建了pCAMBIA1301-antiSAMS重组质粒,然后使用三亲交配法,将这个重组质粒导入到发根农杆菌LBA9402中,并对茶树通过发根农杆菌转化,适宜的转化条件为:采用了YMB培养基共培养;不添加PVP进行预培养;选择60d-70d的苗龄的茎段外植体,从而得到了大量的发状根,经GUS化学检测证明pCAMBIA1301-antiSAMS重组质粒已经转入到发状根里。用不同剂量和不同时间的紫外处理SAM和TCS合成酶基因,结果发现紫外胁迫对影响咖啡因合成的主要生化酶SAM和TCS基因基本没有响应,只有在高剂量长时间(191.2μw/cm~2,720min)条件下发生不可逆转的伤害才会影响两种酶基因的表达。茶儿茶素是茶多酚中最重要的物质。主要有EGCG等8种,这些化合物是茶叶主要的品质成分和功能性成分。它可以抗氧化、抑制肿瘤、保护心血管系统和抗微生物等作用。因此,培育高儿茶素茶品系也是目标育种的一个方向。茶叶中儿茶素含量和组成的差异主要受到品种和栽培环境条件的影响,而环境因素中以太阳辐射对茶叶儿茶素含量和组成影响最大。本文就紫外不同辐射剂量和辐射时间对茶树叶片儿茶素的变化进行了研究,发现低剂量的UV-B条件下,茶

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1．1 S-腺苷甲硫氨酸及其合成酶基因(SAM)

1．1．1 S-腺苷甲硫氨酸

1．1．2 SAM合成酶及其基因

1．1．3 SAM的生化功能

1．1．3．1 转甲基作用

1．1．3．2 转巯基作用

1．1．3．3 参与多胺合成

1．1．4 SAM合成酶基因在植物上的研究

1．1．5 SAM在茶树上咖啡因生物合成调控中的利用

1．2 茶树咖啡因合成酶基因(TCS)

1．3 反义RNA技术

1．3．1 反义技术的操作原理

1．3．2 反义RNA操作的技术要点

1．3．2．1 反义RNA表达载体构建

1．3．2．2 转化及表达

1．3．3 反义RNA技术在植物研究中的应用

1．3．3．1 反义RNA技术在作物品质改良中的应用

1．3．3．2 反义RNA技术在作物杂交育种中的应用

1．3．3．3 反义RNA技术在园艺植物育种中的应用

1．3．3．4 反义RNA技术在果蔬采后生理调控的应用

1．3．3．5 反义RNA技术在植物抗病中的应用

1．3．3．6 反义RNA技术在其他植物生理研究中的应用

1．4 植物转基因技术进展

1．4．1 直接基因转化系统

1．4．1．1 基因枪介导基因转化法

1．4．1．2 脂质体介导基因转化法

1．4．1．3 PEG介导基因转化法

1．4．1．4 显微注射介导基因转化法

1．4．1．5 电激介导基因转化法

1．4．1．6 离子束介导基因转化法

1．4．1．7 激光微束介导基因转化法

1．4．2 种质转化系统

1．4．2．1 花粉管通道介导基因转化法

1．4．2．2 生殖细胞浸泡介导基因转化法

1．4．3 外源基因转化系统

1．4．3．1 根癌农杆菌

1．4．3．2 发根农杆菌

1．4．3．3 农杆菌转化的影响因素

1．4．4 茶树基因转化研究现状

1．4．4．1 茶树基因枪遗传转化研究

1．4．4．2 茶树农杆菌介导基因转化法

1．5 儿茶素研究进展

1．6 目的和意义

1．7 研究内容和技术路线

1．8 创新之处

1．9 参考文献

第二章 SAM合成酶基因反义表达载体的构建

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．1．1 质粒菌种材料

2．1．1．2 酶及主要试剂

2．1．1．3 引物设计

2．1．1．4 主要仪器

2．1．2 方法

2．1．2．1 总RNA提取

2．1．2．2 cDNA第一链合成

2．1．2．3 RT-PCR反应

2．1．2．4 SAM合成酶反义基因真核表达载体的构建

2．1．2．5 SAM合成酶反义基因表达载体鉴定

2．2 结果与分析

2．2．1 茶树RNA的提取

2．2．2 RT-PCR目的基因的扩增

2．2．3 反义基因表达载体的构建和鉴定

2．3 讨论

2．4 参考文献

第三章发根农杆菌介导的茶树pCAMBIA1301-SAMS遗传转化

3．1 材料和方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株及转化的质粒

3．1．3 三亲交配法

3．1．4 农杆菌的PCR验证

3．1．5 农杆菌活化及转化

3．1．6 潮霉素抗性筛选

3．1．7 GUS表达组织化学检验

3．2 结果与分析

3．2．1 农杆菌的PCR验证

3．2．2 潮霉素抗性筛选

3．2．3 不同菌株侵染

3．2．4 不同共培养培养基

3．2．5 不同预培养

3．2．6 不同苗龄时间

3．2．7 不同外植体

3．2．8 GUS染色结果

3．3 讨论

3．4 参考文献

第四章紫外胁迫对SAM和TCS合成酶基因的表达调控

4．1 材料和方法

4．1．1 材料

4．1．1．1 材料

4．1．1．2 酶及主要试剂

4．1．1．3 引物设计

4．1．1．4 主要仪器

4．1．2 方法

4．1．2．1 总RNA提取

4．1．2．2 cDNA第一链合成

4．1．2．3 PCR反应条件和反应程序

4．1．2．4 琼脂糖电泳分析

4．2 结果与分析

4．2．1 总RNA提取

4．2．2 RT-PCR分析

4．3 讨论

4．4 参考文献

第五章紫外胁迫对茶树叶片儿茶素积累的影响

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 试验处理

5．1．2．1 UV-B不同处理时间

5．1．2．2 UV-B不同光照强度

5．1．2．3 UV-B基因表达处理

5．1．3 引物设计

5．1．4 样品分析

5．1．5 数据分析

5．1．6 RT-PCR

5．2 结果与分析

5．2．1 茶树叶片儿茶素类含量随UV-B处理时间的变化

5．2．2 茶树叶片儿茶素类含量随UV-B处理强度的变化

5．2．3 RNA提取

5．2．4 RT-PCR

5．3 讨论

5．4 参考文献

第六章总结

6．1 SAM反义基因构建及其遗传转化

6．2 紫外胁迫对咖啡合成中关键酶基因影响

6．3 紫外胁迫对儿茶素积累影响

附录：缩略词表

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].茶树β-葡萄糖苷酶基因克隆、表达和分布定位[D]. 李远华.安徽农业大学2003
[2].Tea Polyphenols Biosynthesis and Genes Expression Control in Tea (Camellia Sinensis)[D]. MAMATI,George Edward.浙江大学2005
[3].Ri质粒对茶树和苦瓜的遗传转化及相关功能成分研究[D]. 毛清黎.湖南农业大学2006
[4].茶树类胡萝卜素累积及其相关基因表达模式研究[D]. Devajit Borthakur.浙江大学2008
[5].水分胁迫下茶树的生理响应及其分子基础[D]. 郭春芳.福建农林大学2008
[6].茶树品种（系）亲缘关系与遗传多样性分析[D]. 陈盛相.四川农业大学2013
[7].新梢白化茶树品种白化机理研究[D]. 杜颖颖.浙江大学2009
[8].不同茶树品种、生产季节和加工方法对茶叶挥发性化合物的影响[D]. 康受姈（KANG SUYOUNG）.浙江大学2016
[9].茶树品种及儿茶素氧化与其防癌效应的比较和机制研究[D]. 王一君.安徽农业大学2014

茶树主要品质性状关键基因的反义基因遗传转化及表达研究

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