桑黄液体发酵和桑黄多糖提取纯化的研究

论文摘要

桑黄是一种具有很高药用价值及广泛应用前景的真菌,目前所知桑黄中的主要活性成分为桑黄多糖。本文对影响桑黄液体培养的理化因子进行了研究,以菌丝生物量为指标,筛选了适宜桑黄液体培养的配方和培养条件,并对桑黄菌丝体里的多糖进行了提取与分离纯化试验研究。其主要内容有:理化因子对桑黄液体发酵菌丝生物量的影响研究,桑黄多糖的提取和纯化工艺研究。不同碳源因素试验显示:在供试的6种碳源中,玉米粉为最佳碳源,而且价格便宜,适宜大规模工业化生产使用。不同氮源因素试验显示:在供试的5种氮源中,黄豆粉对菌丝生物量的影响优于其他氮源,因此选择黄豆粉为最佳氮源。无机盐及生长因子的试验显示:磷酸二氢钾、硫酸镁对菌丝的生长有促进作用。在碳源、氮源和无机盐的基础上,进行了培养基配比正交实验,确定了桑黄液体发酵的最佳培养基配比为玉米粉4%、黄豆粉1.5%、磷酸二氢钾O.1%、硫酸镁0.1%。以碳源、氮源为影响因子的菌丝生物量的响应面方程为:z=1.7950x+1.1967y-0.1967x2-0.1267y2-0.1850xy-2.9722,式中:z-为菌丝生物量,x-为碳源,y-为氮源。培养条件因子中研究了温度、pH值、装液量、转速、接种量、培养时间等因子对桑黄液体发酵中菌丝产量的影响。试验结果:桑黄的菌丝体在pH6.5的条件下,按15%的接种量接种于装有100ml最佳培养基的250ml摇瓶中,在130r/min振荡培养箱中26C,恒温发酵培养7d,即可得到大量的菌丝体。桑黄粗多糖的提取工艺与提取时间、提取温度、提取次数、溶剂比有密切关系。本实验采用热水浸提法,对这些单因素影响进行了逐一试验,得到桑黄多糖的最佳提取时间为2.5h,最佳提取温度为60℃,最佳提取次数为3次,最佳料液比为14倍。采用了Sevag法对桑黄粗多糖进行去蛋白试验,设计了三因素三水平的正交试验,试验结果为,去蛋白质的最佳条件是Sevag溶液中氯仿和正丁醇的体积比为10:3,样品和Sevag溶液的体积比为1:1,振荡时间为10min。以样品和Sevag溶液的体积比,氯仿和正丁醇的体积比为影响因素的蛋白去除率响应面方程:z=121.5167x+32.449y-50.0999x2-4.4299y2-2.5600xy-46.7733,式中:z-蛋白质去除率/%,x-样品:Sevag溶液（V:V）,y-氯仿:正丁醇（V:V）。本研究采用了大孔吸附树脂（AB-8）、DEAE-纤维素对桑黄多糖进行了初步的分离,然后用凝胶柱层析（Sephadex G-100）进一步纯化,经过初步分离后,得到多糖含量相对稍高的两个组分H-A和H-B,为了进一步分离,根据分子量大小对H-A和H-B用凝胶柱层析（Sephadex G-100）进一步纯化,得到多糖含量较高的H-A1、多糖含量达到95.6%,H-B1多糖含量达到97.21%,由此可知通过凝胶柱层析（Sephadex G-100）可以很好地将多糖纯化和分级。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 2 引言
• 3 实验材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种及其来源
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器和试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 发酵培养主要指标的测定方法
• 3.2.2 培养基成分和液体发酵条件对菌丝生物量的影响
• 3.2.3 桑黄菌丝体中桑黄多糖的提取工艺
• 3.2.4 Sevag法去蛋白
• 3.2.5 桑黄多糖纯度的测定
• 3.2.6 桑黄多糖的分离纯化
• 4.结果与分析
• 4.1 培养基成分和液体发酵条件对菌丝生物量的影响
• 4.1.1 培养基成分对桑黄菌丝生物量的影响
• 4.1.2 液体发酵条件对菌丝生物量的影响
• 4.2 桑黄菌丝体中桑黄粗多糖的提取工艺
• 4.2.1 标准曲线
• 4.2.2 提取温度对桑黄粗多糖提取率的影响
• 4.2.3 提取时间对桑黄粗多糖提取率的影响
• 4.2.4 料液比对桑黄粗多糖提取率的影响
• 4.2.5 提取次数对桑黄粗多糖提取率的影响
• 4.2.6 醇沉倍数对桑黄发酵液中粗多糖提取率的影响
• 4.2.7 桑黄粗多糖提取验证试验
• 4.2.8 去除蛋白方法的确定
• 4.2.9 建立响应面方程
• 4.3 桑黄菌丝体中粗多糖组分的分离、纯化
• 4.3.1 桑黄多糖的纯度测定
• 4.3.2 Sevag法去蛋白后的样品经大孔树脂粗分
• 4.3.3 DEAE-纤维素对粗分的样品分离
• 4.3.4 凝胶柱层析（Sephadex G-100）
• 5. 讨论
• 5.1 培养基成分对桑黄液体发酵菌丝生物量的影响
• 5.2 发酵条件桑黄液体发酵菌丝生物量的影响
• 5.3 有机原料的处理
• 5.4 桑黄菌丝体中桑黄粗多糖的提取工艺
• 5.4.1 桑黄发酵液中的桑黄多糖
• 5.4.2 提取温度对桑黄粗多糖提取率的影响
• 5.4.3 测定糖含量的方法对试验结果的影响
• 5.5 桑黄粗多糖的分离纯化
• 5.5.1 去蛋白的方法
• 5.5.2 不同的浓缩方法
• 5.5.3 凝胶层析
• 6. 结论
• 6.1 桑黄菌的液体发酵条件的研究
• 6.2 桑黄菌丝体中的桑黄粗多糖的提取工艺
• 6.3 桑黄粗多糖的最佳去蛋白条件
• 7. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介