日本血吸虫22.6kDa表膜蛋白功能的初步研究

论文摘要

日本血吸虫病是中国严重的寄生虫病之一,政府每年投入大量资金用于血吸虫的防治工作,然而由于血吸虫生活史的复杂性,血吸虫病的仍然没有得到很好的控制。血吸虫病控制的重要措施之一在于建立准确而又灵敏的诊断方法。本研究即以寻找新的诊断抗原为目的,用感染兔血清免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的24个持续阳性克隆进行测序分析,其中13个是日本血吸虫22.6kDa膜相关蛋白（Sj22.6）基因,这表明Sj22.6基因在日本血吸虫童虫表膜高丰度表达,故推测其具有一定诊断作用。为验证该作用,我们设计引物体外成功扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。在37℃下,OD600为0.6时,加入IPTG（异丙基硫代-β-半乳糖苷,最终浓度1mmol/L）进行诱导,通过SDS-PAGE电泳发现诱导4小时后表达量最大且为可溶蛋白。重组蛋白通过镍柱亲和层析纯化。纯化后的蛋白免疫4只BABL/c小鼠,多抗效价皆高于1:16 000,说明所表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。再通过Western blotting方法发现可以被日本血吸虫感染兔血清强烈识别而不被正常兔血清识别,说明本实验表达蛋白具有免疫反应性。同时,该蛋白也可被急性日本血吸虫病人血清以及慢性日本血吸虫病人血清识别而不与正常人反应,说明其可能具有一定诊断潜力。然而在检测日本血吸虫感染兔血清时,我们只获得77.8%（14/18）阳性率,以及高达22.2%（4/18）假阳性率。我们还对两批人血清进行检测,经反复检测,第一批血清（18份急性日本血吸虫病人血清和18份正常人血清）rSj22.6阳性率仅为5.6%（1/18）,假阳性率为5.6%（1/18）;而日本血吸虫成虫粗抗原（AWA）阳性率为61.1%（11/18）,假阳性率为5.6%（1/18）。而第二批人血清（15份急性日本血吸虫病人血清和15份正常人血清）rSj22.6阳性率仅为26.7%（4/15）,假阳性率为6.7%（1/15）;而AWA阳性率为93.3%（14/15）,假阳性率为6.7%（1/15）。检测结果初步否定了rSj22.6蛋白作为诊断抗原的作用。另外,本课题组还对rSj22.6蛋白抗凝血功能作初步研究,当rSj22.6蛋白达到200μg/ml时,PT与APTT时间开始出现延长现象,并在本实验所容许的最大蛋白浓度800μg/ml下,PT延长4.5s而APTT延长12s。在本实验条件下,PT与APTT时间与rSj22.6浓度成剂量相关,但延长效果较弱。我们还将rSj22.6蛋白与牛凝血酶按照不同的物质的量比混合并分别于23℃孵育,然后12 000g 4℃离心15min,留取上清,以rSj22.6蛋白免疫的小鼠血清作抗体,Western Blotting发现与牛凝血酶作用的rSj22.6蛋白与抗体的反应强度比单纯的rSj22.6蛋白要弱,而且与牛凝血酶作用的rSj22.6蛋白出现比rSj22.6蛋白稍小的条带,这说明牛凝血酶能结合并能水解rSj22.6蛋白。本实验初步证实了rSj22.6蛋白具有良好的免疫原性以及免疫反应性,但不适合作为诊断抗原。该蛋白具有一定的抗凝血功能,可以与牛凝血酶结合,并能被水解。rSj22.6蛋白的抗凝功能可能是通过与凝血酶相互作用而发挥抗凝血作用。

论文目录

• 中英文词汇对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 结果
• 3.1 日本血吸虫（中国大陆株）童虫 cDNA 文库的筛选
• 3.2 阳性克隆测序结果
• 3.3 Sj22.6 基因测序的同源性分析
• 3.4 Sj22.6 重组质粒的 PCR 与双酶切鉴定
• 3.5 rSj22.6 蛋白诱导表达
• 3.6 rSj22.6 蛋白纯化
• 3.7 rSj22.6 Western blotting 分析结果
• 3.8 rSj22.6 免疫小鼠抗体效价检测
• 3.9 rSj22.6 ELISA 实验
• 3.10 rSj22.6 的 PT 与 APTT 实验
• 3.11 牛凝血酶与 rSj22.6 蛋白结合实验
• 讨论
• 4.1 日本童虫血吸虫cDNA文库免疫筛选
• 4.2 rSj22.6蛋白表达与纯化
• 4.3 rSj22.6蛋白的免疫反应性及免疫原性鉴定
• 4.4 rSj22.6 蛋白用于 ELISA 免疫诊断研究
• 4.5 rSj22.6对凝血过程的影响研究
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢
• 综述
• 参考文献