鸡组织中三种氟喹诺酮类药物残留检测的Ci-ELISA法及消除规律

论文摘要

左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星属于第三代氟喹诺酮类药物,因为它们普遍具有抗菌谱广、抗菌活性强、消化吸收好与其他种类抗菌药物无交叉反应等特点,现已广泛大量地应用于畜禽养殖生产及临床用药上。由于其存在着潜在的毒副作用加上此类药物的大量及不合理使用,使得氟喹诺酮药物残留所带来的危害越来越受到关注,为了保障鸡肉产品的安全,需要建立一种高效、灵敏的药物残留检测技术。本研究采用了免疫分析法中的间接竞争酶联免疫吸附测定法（Ci-ELISA）,用左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星作为半抗原,制备出抗血清,分别建立Ci-ELISA去对鸡组织中氟喹诺酮药物残留进行检测并研究其消除规律。主要结果如下:1.左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星人工抗原的合成鉴定及抗体的制备用N-羟基琥珀酰亚胺法把左氧氟沙星（LVL）、恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIF）、分别与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）偶联制备免疫抗原;用氯甲酸异丁酯法把左氧氟沙星（LVL）、恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIF）分别与鸡卵清蛋白（OVA）偶联,制备包被检测抗原,采用紫外扫描法对合成的抗原进行鉴定,结果表明:免疫抗原和包被抗原均成功制备,结合比LVL-BSA、ENR-BSA、CIF-BSA、LVL-OVA、ENR-OVA、CIF-OVA,依次为10.6、11.6、13.6、5.1、5.2、6.8。用三种人工免疫抗原LVL-BSA、ENR-BSA、CIF-BSA分别免疫家兔,制备出相应的抗血清,用ELISA法进行抗体效价检测,抗血清中的抗体效价均达到1:212以上,说明抗血清的制备是成功的。2.三种氟喹诺酮类药物残留Ci-ELISA检测方法的建立实验先对LVL、CIF、ENR进行交叉反应性的测定,测定结果表明,三种药物与氟喹诺酮类药物都具有一定的交叉反应,其中ENR与CIF的交叉反应最大。通过对Ci-ELISA法实验条件的优化得到如下最佳反应参数:最适包被抗原工作浓度分别为1:200、1:200、1:400;抗LVL、ENR、CIF血清的最佳工作浓度为1:3200、1:6400、1:3200;最佳孵育时间为2h;酶标二抗（羊抗兔IgG-HRP）的稀释度为1:5000。在上述优化的Ci-ELISA法反应参数的基础上,分别建立了LVL、ENR、CIF残留检测的Ci-ELISA法。具体结果如下:LVL检测的标准曲线的线性回归方程为Y=-0.2894X+0.0495（R2=0.9878）,中值(IC50)为64ng/mL,最低检测限（LOD）为10ng/mL,标准曲线的线性范围为10～1000ng/mL;ENR检测的标准曲线的线性回归方程为Y=-0.2186X+0.216（R2=0.9843）,中值(IC50)为36ng/mL,最低检测限（LOD）为10ng/mL,标准曲线的线性范围为10～1000ng/Ml;CIF检测的标准曲线的线性回归方程为Y=-0.219X+0.1661（R2=0.9885）,中值(IC50)为24ng/mL,最低检测限（LOD）为10ng/mL,标准曲线的线性范围为10～1000ng/mL。通过添加回收试验,左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星药物在鸡肌肉、肝脏、肾脏组织中的平均添加回收率均在80%以上,批内和批间变异系数均低于15%,均达到了药物残留分析的要求。3.Ci-ELISA检测方法研究鸡组织中三种氟喹诺酮类药物残留消除规律本研究是以左氧氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星3种FQs药物为对象,肉鸡按30mg/kg灌服给药,结果表明:3种FQs药物在停药96h后,在鸡组织中,肌肉中的药物浓度已经低于检测限,而肝脏、肾脏中仍可检测到;停药120h后,各组织中的药物浓度均低于检测限。实验结果表明,本文用三种不同的氟喹诺酮类药物作为抗血清建立了Ci-ELISA检测氟喹诺酮类药物残留的方法,具有灵敏度高、精密度好、检测范围宽、最底检测限底的特点,达到了氟喹诺酮类药物残留分析的要求,具有一定的实践意义。

论文目录

• 中文摘要
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• 目录
• 本文常用英文缩写词
• 文献综述
• 1.引言
• 2.材料方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1溶液配置
• 2.2.2 人工免疫抗原的合成与鉴定
• 2.2.3 动物免疫
• 2.2.4 抗体效价的测定
• 2.2.5 标准曲线及相关参数
• 2.2.6 方法的精密度测定
• 2.2.7 交叉反应性的测定
• 2.2.8 添加回收试验
• 2.2.9 鸡组织中左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星残留的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 人工抗原的合成与鉴定
• 3.1.1 紫外光谱扫描图谱分析
• 3.1.1.1 左氧氟沙星紫外光谱图谱分析
• 3.1.1.2 恩诺沙星紫外光谱图谱分析
• 3.1.1.3 环丙沙星紫外光谱图谱分析
• 3.2 抗血清效价的测定结果
• 3.2.1 左氧氟沙星抗体血清效价的测定结果
• 3.2.2 恩诺沙星抗体血清效价的测定结果
• 3.2.3 环丙沙星抗体血清效价的测定结果
• 3.3 标准曲线的建立
• 3.3.1 左氧氟沙星的标准曲线和线性范围
• 3.3.2 恩诺沙星的标准曲线和线性范围
• 3.3.3 环丙沙星的标准曲线和线性范围
• 3.4 交叉反应率的测定结果
• 3.4.1 左氧氟沙星的交叉反应率
• 3.4.2 恩诺沙星的交叉反应率
• 3.4.3 环丙沙星的交叉反应率
• 3.4 鸡组织中三种氟喹诺酮的回收率
• 3.4.1 鸡组织中左氧氟沙星的回收率
• 3.4.2 鸡组织中恩诺沙星的回收率
• 3.4.3 鸡组织中环丙沙星的回收率
• 3.5 精密度
• 3.6 鸡组织中左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星药物残留检测
• 3.6.1 鸡组织中左氧氟沙星药物残留检测
• 3.6.2 鸡组织中恩诺沙星药物残留检测
• 3.6.3 鸡组织中环丙沙星药物残留检测
• 4 讨论
• 4.1 人工抗原的合成与鉴定
• 4.1.1 人工抗原合成路线的选择
• 4.1.2 载体蛋白的选择
• 4.1.3 人工抗原的鉴定
• 4.1.4 人工抗原的纯化
• 4.2 抗体的制备
• 4.2.1 动物的免疫
• 4.2.2 效价的测定
• 4.3 建立的ELISA检测方法
• 4.3.1 方法的交叉反应性
• 4.3.2 方法的组织回收率
• 4.3.3 方法的检测限和精密度
• 4.3.4 三种FQs药物在鸡组织中的残留消除规律
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附作者在读期间发表的学术论文