论文摘要
分子印迹技术（Molecularly imprinted technique, MIT）是在模拟生物体内抗原与抗体相互作用的“锁匙”原理基础上发展起来的新型分子识别技术,对目标分子具有特殊的亲和性及高度的选择性。这种卓越的分子识别性能来自于分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymer, MIP）,即在空间结构和结合位点上与所识别分子完全匹配的一种合成聚合物。MIP具有可预定性、高选择性、性能稳定、制备简单等特点,被称为“人工抗体”,在仿生传感器、固相萃取、抗体模拟、液相固定相、酶催化模拟、手性拆分以及药物控释等领域被广泛应用。分子印迹固相萃取（Molecularly Imprinted-Solid Phase Extraction, MISPE）,是将MIT与固相萃取（Solid Phase Extraction, SPE）联用的一种新型分离技术,即以MIP作为SPE的吸附剂,用于分离、富集与分析复杂样品中特定的目标分子。MISPE不仅具有SPE的优点,填充的具有高度识别性能的MIP,又赋予MSPE更优的功能,能选择性地富集样品中的目标分子,有效去除干扰成分及杂质,成为分离分析复杂基质低含量目标分子的一种强有力的手段。本论文以烟酰胺（Nicotinamide, NAM）为研究对象,选择合适的聚合方法及工艺制备NAM-MIP,对其结构及性能进行表征及评价。将NAM-MIP作为SPE的吸附剂,采用NAM-MISPE技术对血清、尿液等生物样品中的NAM进行分离富集与分析。1.研究目的及内容以烟酰胺（NAM）为模板分子,采用两步溶胀聚合法制备一种新型的聚合物微球NAM-MIP,对其结构及性能进行表征及评价；将NAM-MIP作为SPE吸附剂制备NAM-MISPE柱,用于分离富集血清、尿液中的NAM,建立一种特异性富集生物样品中目标物的前处理分析方法。（1） NAM-MIP制备方法的选择及工艺优化。（2） NAM-MIP的结构表征及性能评价。（3） NAM-MISPE在生物样品分析中的应用。2.方法2.1 NAM-MIP的制备及工艺优化（1）采用溶胀聚合法、本体聚合法、悬浮聚合法及沉淀聚合法分别制备NAM-MIP及空白印迹聚合物NIP,计算印迹聚合物的平衡吸附量Q（μmol/g）、特异性吸附量⊿Q（μmol/g）、分配系数K （mL/g）以及印迹因子α,确定NAM-MIP的制备方法。（2）以吸附量Q、聚合物形态为指标,对影响两步溶胀聚合法制备NAM-MIP的工艺参数包括功能单体MAA的用量、致孔剂的种类、搅拌速度、水油比（V水/VEGDMA）、分散剂与乳化剂的用量以及聚合温度等进行考察,确定两步溶胀聚合法制备NAM-MIP的最适工艺。2.2 NAM-MIP的结构表征及性能评价（1）按优化工艺制备NAM-MIP及NIP,采用扫描电镜、粒径分析、红外光谱等手段对其形貌及结构进行表征。（2）通过等温吸附曲线、Scatchard分析及动力学曲线等对NAM-MIP的吸附性能进行评价。（3）采用静态吸附法评价NAM-MIP对不同底物的结合性能；将各底物混合液上样于NAM-MISPE柱,测定淋洗液、洗脱液中各底物的回收率,考察NAM-MIP对不同底物的竞争性吸附能力。2.3 NAM-MISPE在生物样品分析中的应用（1）含有适量NAM的健康成人尿液、血清上样NAM-MISEP柱,通过淋洗、洗脱条件的优化,选择性分离富集生物体液中的NAM。（2）采用HPLC法建立基于分子印迹技术的尿液、血清中NAM的含量测定方法。3.结果3.1 NAM-MIP的制备方法的确定采用4种不同聚合方法法制备的NAM-MIP,其对NAM的吸附量Q大小：溶胀聚合法≈沉淀聚合法≈本体聚合法>悬浮聚合法；特异性吸附量（?）Q大小：溶胀聚合法≈沉淀聚合法>本体聚合法=悬浮聚合法。综合考虑聚合物的粒径、得率、吸附量及特异性吸附量等参数,确定选择两步溶胀聚合法制备NAM-MIP, Q=38.2μmol/g、KMIP=28.7 mL/g、α=2.96。3.2 NAM-MIP制备工艺的优化MAA的用量、聚合温度等主要影响NAM-MIP的吸附性能,致孔剂、搅拌速度、分散剂与乳化剂的用量及水油比（V水/VEGDMA）等主要影响MIP的形态及粒径大小。以吸附量Q及粒子形态为指标,通过单因素考察,确定两步溶胀聚合法制备NAM-MIP的最适工艺：模板分子NAM为1mmol,功能单体MAA 6 mmol,交联剂EGDMA 30 mmol,致孔剂甲苯10 mL,聚合温度75℃,搅拌速度200 rpm,0.15% SDS,1.75% PVA,水油比（V水/VEGDMA）为25：1,制得的NAM-MIP单分散性好、粒径均匀、静态吸附性能及选择性吸附性能优良。3.3 NAM-MIP的结构表征采用优化工艺制备的NAM-MIP表面粗糙,有复杂的多孔结构,而NIP表面光滑,没有明显的多孔结构。粒径主要分布在10-40μm之间,平均为25μm左右。IR表明,交联剂EGDMA和功能单体MAA基本全部参加了聚合反应；洗脱模板分子前后的聚合物,羟基吸收峰存在明显差异,NAM-MIP在3630 cm-1处有明显的-OH伸缩振动吸收峰,提示MIP上的孔穴及暴露的—OH可能是其具有特殊分子识别性能的关键。3.4 NAM-MIP对模板分子NAM的结合性能NAM-MIP对模板分子NAM的吸附量明显高于NIP,在浓度为3mmol/L时基本达到吸附平衡；经Scatchard分析证明NAM与NAM-MIP之间存在两类不等价的结合位点,低亲和力结合位点的平衡解离常数Kd1=0.178mmol/L、最大表观结合量Qmaxl=15.26μmol/g;高亲和力结合位点Kd2=3.65 mmol/L、Qmax2=149.34μmol/g; NIP对NAM存在一类等价的结合位点,Kd=2.06 mmol/L、Qmax=50.0μmol/g。动力学曲线表明,NAM-MIP在1.5 h内对NAM吸附迅速,吸附速率快,到7h左右达到吸附平衡。3.5 NAM-MIP对NAM结构类似物的结合性能及竞争性吸附性能NAM-MIP对NAM的结构类似物也表现出一定的结合能力,对NA的吸附量最大（Q=23.8μmol/g）,其次为3-PM （Q=18.8μmol/g）及BA （Q=16.5μmol/g）,吸附最弱的是BM （Q=6.3μmol/g）,但都远小于对模板分子NAM的吸附量（Q=64.5μmol/g）;各底物混合液上样NAM-MISPE柱,经淋洗、洗脱后发现,NAM对MIP作用位点的竞争力最强,洗脱液中NAM的回收率为88.3%,其次是NA（56.6%）,最弱的是3-PM（29.2%）。3.6 NAM-MISPE在生物样品分析中的应用含NAM的血清、尿液上样NAM-MISPE柱,以NAM的回收率为指标,对淋洗、洗脱条件进行优化,确定以0.5 mL甲醇淋洗NAM-MISPE柱、3.0 mLx2甲醇/醋酸（9：1,v/v）洗脱MISPE柱,能使生物样品中的NAM得到有效富集。建立了基于MISPE的血清、尿液中NAM的分析方法：NAM对照品尿液的标准曲线方程为：y=96.472x-80.254 （r=0.9948）, NAM对照品血清的标准曲线方程为：y=0.0145x+0.159（r=0.9975）,在尿液、血清中浓度范围0.499μg/mL～19.96μ/mL,线性关系良好；最低检测限为0.3μg/mL、定量限为0.9μg/mL;精密度≤2.86%;NAM对照品在尿液的相对回收率为98.8%-86.0%、RSD为1.89%-4.44%；在血清的相对回收率为96.8%-87.0%、RSD为2.27%-3.19%之间。4.结论4.1采用两步溶胀聚合法制备NAM-MIP微球的最适工艺：模板分子NAM为1mmol,功能单体MAA6mmol,交联剂EGDMA 30mmol,致孔剂甲苯10 mL,聚合温度75℃,搅拌速度200 rpm,0.15% SDS,1.75% PVA,水油比（V水/VEGDMA）为25：1。制得的NAM-MIP单分散性好、粒径均匀（10-40μm）,表面粗糙有明显的多孔结构。对NAM的吸附量为Q=64.5μmol/g, KMIP=24.8 mL/g、α=2.60。明显高于NIP （Q=24.8μmol/g）。4.2 NAM-MIP对NAM的吸附与底物的浓度及吸附时间有关,NAM在初始的1.5 h内吸附迅速、速率快,到7h左右基本达到吸附平衡。吸附时,二者之间存在两类不等价的结合位点,即非特异性吸附主导的低亲和力结合位点及特异性吸附主导的高亲和力结合位点；而NIP仅有一类等价的非特异性结合位点。4.3 NAM-MIP对NAM具有专一的吸附选择性,MIP的孔穴与NAM空间结构匹配,MIP中MAA的—OH与NAM结构中的吡啶环、>C=O之间形成的静电、氢键等作用,是影响分子之间发生精确识别的重要因素。NAM-MIP对NAM结构类似物的吸附与各底物的空间结构及官能团有关。4.4以NAM-MIP作为SPE的吸附剂制备的NAM-MISPE柱,能特异性分离富集血清、尿液中的NAM；建立的基于MISPE分析生物样品中目标物的方法,专属性强、准确可靠、操作简便,精密度好,满足生物样品的测试要求。
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