论文摘要
结球大白菜（Brassica rapa L．ssp．pekinensis），原产于我国，是我国北方重要蔬菜之一，广泛种植在东亚地区。结球大白菜软腐病是由软腐病菌（Erwinia carotovorasubsp．carotovora）引起的，是结球大白菜三大病害之一，造成结球大白菜大量减产和品质下降。目前生产上高抗软腐病品种资源少，加之对结球大白菜抗病机制认识的匮乏，从而严重影响了抗软腐病育种工作进程。为从分子水平研究和理解结球大白菜抗软腐病的分子机制，本文通过对受软腐病菌感染的结球大白菜SSH cDNA文库进行大规模测序、构建ESTs（基因表达序列标签）数据库、开发数据库管理软件和制作cDNA芯片，对结球大白菜抗软腐病基因表达谱进行了分析。在此基础上，研究了木质素的合成在结球大白菜防卫软腐病反应中的变化。研究的主要结果如下：1、结球大白菜ESTs数据的获取与分析本研究对已构建的SSH cDNA文库进行测序，获取了5，242条高质量ESTs，连同实验室以前所测的部分序列，最终共获得了6，282条ESTs。经利用DNAStar6.0的SeqmanⅡsoftware进行序列拼接分析，将6，282条ESTs生成2，975个序列簇（UniESTs），其中包括1，173条contigs（片段重叠群）和1，802条singletons（单序列）。通过BLAST（x）分析对UniESTs在本地化的非冗余数据库中（下载自NCBI站点）进行了功能注释，然后根据推测功能进行分类．功能已知部分有1，978条，分为11类，其中包含UniESTs数目较多的几个类别是：基础代谢基因426个（14.33％），防卫和胁迫相关基因262个（8.81％），物质运输相关基因247个（8.30％），能量代谢基因183个（6.16％），信号转导有关基因179个（6.02％）和次生代谢基因160个（5.38％）。在功能未知部分中，与当前非冗余数据库中已知基因生物学相似性不显著的有485个（16.31％），包括49 uniESTs结果为无纪录发现（no hits found），可能是新基因序列；512条uniESTs虽然与其它基因有生物学相似性，但是其基因功能未知，需要深入研究。对文库中基因的出现频次进行统计，发现有61个（2.05％）基因的ESTs出现频次大于10次，主要由光合作用和防卫反应相关基因组成。前者包括捕光叶绿素a／b结合蛋白、氧气释放蛋白复合体、NADPH氧化还原酶和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶等基因；后者包括几丁质酶、热休克蛋白、衰老相关蛋白、防卫素和PR4蛋白等基因。2、结球大白菜ESTs数据库的构建及相关程序的开发为了加速数据分析进程，本研究应用Phred、DNAstar等生物信息学软件以及我们自己开发的PERL程序和ESTs数据转换软件Convert对结球大白菜SSH cDNA中的ESTs数据进行了整理和分析，然后构建了专门存放结球大白菜ESTs信息的数据库，开发了结球大白菜数据库管理软件Genemaster和数据库网站查询系统。该数据库存放ESTs数据格式与GenBank中dbEST数据库的相似。这一数据分析管理系统的建立为ESTs数据的搜集、整理、分析、储存、管理和利用提供了方便。3、cDNA芯片的制作与抗软腐病基因表达谱分析为了检测结球大白菜受软腐病侵染过程中基因表达变化，本文对所获取的软腐病菌感染的结球大白菜SSH cDNA文库的6，282条ESTs和结球叶片cDNA文库的2，372条ESTs进行拼接分析后，从中挑选出4，128条ESTs，用于制备结球大白菜cDNA芯片；并利用基因芯片检测在接种软腐病后6个时间点的结球大白菜基因表达变化。结果显示，共有913（22.11％）个基因被检测到差异表达，其中有488个基因上调表达，309个下调表达，116个基因在不同时间点上调或下调表达．不同接种时间差异表达的基因数目也有变化，从0.5小时到2小时为上升期，在6小时开始下降，然后，随着时间的延长表达的基因数目逐渐减少，尤其在接种后24小时的上调和下调表达基因数目仅为接种后2小时的1／2和1／4。这说明侵染的前6小时结球大白菜对寄主植物的调控比较剧烈，该时期是结球大白菜对软腐病菌防卫反应重要的调控期。通过聚类分析将表达基因分为四大类型，第一类，如光合系统相关基因，在接种后2小时明显上调表达其它时间点逐渐下调或差异不显著，提示光合效率逐渐下降可能与活性氧的破坏相关；第二类，如细胞衰老相关基因、几丁质酶类和过氧化氢酶基因，在接种后半小时表达上调表达，在其它时间点下调表达或差异不显著，提示这些基因可能与结球大白菜的早期过敏性抗病机制有关；第三类，如基础代谢及蛋白质合成相关基因，在接种后半小时和2小时下调表达，在其它时间点上调或差异不显著，表明在病原菌侵染早期结球大白菜的基础代谢和物质合成受到抑制；第四类，主要为参与抗病信号识别、信号转导、信号激素合成、蛋白降解、转录、次生代谢合成、防卫／抗逆反应等类型的基因，在多个时间点上调表达，提示这些基因在对软腐病菌的防卫反应整个过程中起作用。在这四类基因表达类型中，有三分之一的基因为功能未知类型基因，这些基因可能是新发现的受软腐病原菌侵染调控的基因类型，它们在抗病中的作用有待于深入研究。4、木质素在抗软腐病中的作用软腐病菌侵染过程中主要依靠分泌细胞壁降解酶降解植物细胞壁以获取营养，而木质化的植物细胞壁有助于限制病原菌的渗透和扩散。前面的研究表明，木质素合成相关基因在接种后呈上调表达。为了深入研究木质素合成及不同组分在抗软腐病过程中的作用，我们研究了木质素含量、组分以及相关基因的表达。DAB染色结果显示，与健康植株相比，伤害和针刺接种软腐病菌12小时后的植株在其伤害和接种位点都显示红棕色变化，表明在伤口和接种位点都积累H2O2和过氧化物酶活性。与伤害对照相比，在接种后12、24和72小时，Ecc侵染的材料中的Klason木质素的含量分别增加了7.84％、40.37％和43.13％，表明随着病程发展，防卫相关木质素的合成加强。气相色谱-质谱（GC-MS）分析接种处理后72小时叶柄细胞壁的硝基苯氧化组分表明：与健康植株对照相比，伤害对照和接种材料中的对-羟基苯基木质素（H），愈创木基木质素（G）和紫丁香基木质素（S）单体都增加，且G和S比H增加显著。在木质素合成过程中，目前已知共有10种酶参与，主要包括：普通苯丙烷途径的苯丙氨酸解氨酶（PAL），肉桂酸4-羟化酶（C4H）和4-香豆酰CoA连接酶（4CL）；G和S木质素单体合成途径的肉桂酸-3-羟化酶（C3H），咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT），咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT），阿魏酸5-羟化酶（F5H）和对羟基桂皮酰基-CoA-莽草酸／奎宁酸对羟基桂皮酰基转移酶（HCT）；三种单体合成过程中共同需要的肉桂酰-辅酶A还原酶（CCR）和肉桂醇脱氢酶（CAD）等。本研究采用3’／5’RACE法克隆到两个该途径的酶的基因，一个为C4H，全长为1733 bp，其中编码区长1518 bp，推测编码蛋白大小57.63 KD；另一个为CCoAOMT，全长1106bp，编码区长777 bp（57-833），推测编码蛋白29.02 KD。木质素的含量与其合成过程中关键酶基因的表达相联系，我们对12个木质素合成相关基因的表达进行了分析，结果表明，所有基因在伤害和接种处理后都能够被诱导增强表达，这个结果与木质素组分的增加相一致，其中COMT和CCoAOMT的增强表达与G和S单体的增加相吻合。上述结果表明，伤害和Ecc感染所诱导的“防卫木质素”的单体组成与正常发育的不相同；在软腐病菌侵染过程中，植株对G和S单体的调节比较显著。因此，G和S木质素单体可能在对软腐病菌的防卫反应中被积极调控。
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