文心兰AP3-like基因的克隆与表达分析研究

论文摘要

被子植物的AP3家族属于MADS-box基因中的B功能基因,其在花器官形成和生殖发育中有重要的作用。为研究兰花MADS-box基因的表达与花器官发育之间的关系,以文心兰（Oncidium Milliongolds）为材料,本研究通过RT-PCR方法克隆到一个花发育相关的MADS-box基因,通过该基因在花芽不同发育时期和不同组织的表达模式,推测该基因对花器官形成所起的调控作用,为兰花花器官发育的分子调控机制进一步的研究奠定基础,为兰花分子育种提供理论依据。本研究主要结果如下：（1）通过RT-PCR分离得到OAP3基因cDNA的全长,该基因全长799bp,包括一个612bp的CDS框,编码一个长度为203个氨基酸的蛋白质。在GenBank登录（登录号：GU644447）。进化树分析表明OAP3属于花器官发育B类基因,但该基因却不存在B类基因C-端共有的结构域。（2）文心兰OAP3基因蛋白属于AP3-like基因家族中的paleoAP3系列,与其它物种相比,氨基酸序列比对发现该序列与蝴蝶兰PeMADS5的氨基酸序列同源性高达78%,与单子叶植物水稻MADS16和百合LMADS1的氨基酸序列同源性均为62%,明显高于与双子叶植物拟南芥AP3（50%）和金鱼草DEF（50%）的同源性。（3）OAP3基因编码的蛋白质推测其分子量为23661.1D,理论等电点为9.49。其中,碱性氨基酸占总氨基酸的18.23%,酸性氨基酸占总氨基酸的13.80%,疏水氨基酸占总氨基酸的33.00%,极性氨基酸占总氨基酸的34.97%。（4） qRT-PCR表达分析表明：从抽花开始,随花芽的生长,该基因相对表达丰度呈明显上升趋势；OAP3在萼片、花瓣、唇瓣、雄蕊、子房以及营养器官叶片和花茎中都表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 MADS-box基因与花器官的发育
• 1.2 ABC模型及其发展
• 1.3 AP3/PI家族
• 1.3.1 AP3/PI家族的分类
• 1.3.2 AP3/PI家族的时空表达模式
• 1.4 ABC功能基因在兰科植物中的研究进展
• 1.4.1 兰花花发育的特点
• 1.4.2 ABC功能基因与兰花花器官发育
• 1.5 本课题研究的目的与意义
• 1.6 课题来源和经费支持
• 1.7 研究技术路线
• 2 文心兰OAP3基因全长克隆、序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂及菌株
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 总RNA提取
• 2.2.3 反转录
• 2.2.4 RT-PCR扩增
• 2.2.5 扩增产物的克隆、测序及序列分析
• 2.2.6 文心兰OAP3表达载体的构建
• 2.2.7 转化农杆菌
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 特异性扩增产物的获得
• 2.3.2 扩增产物的克隆
• 2.3.3 文心兰OAP3基因序列初步分析
• 2.3.4 OAP3蛋白的生物信息学分析
• 2.3.5 表达载体构建
• 2.4 小结
• 3 OAP3基因的时空表达模式表达模式研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验试剂
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 文心兰花芽形态解剖和显微观察
• 3.2.2 文心兰管家基因actin的分离
• 3.2.3 总RNA提取及纯化
• 3.2.4 反转录反应
• 3.2.5 进行实时荧光定量PCR反应
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 文心兰花芽形态解剖和显微观察
• 3.3.2 文心兰管家基因actin的克隆
• 3.3.3 OAP3基因在文心兰中花芽不同发育时期及不同组织器官的表达
• 3.4 小结
• 4 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 附录C