氧浓度变化对铜绿假单胞菌生物被膜生成的影响

论文摘要

背景:铜绿假单胞菌可以引起各种急慢性感染,并且由该菌引起的院内获得性感染的发病率远高于社区获得性感染,其原因目前并未完全明确。在众多学说中,目前认为产生生物被膜是铜绿假单胞菌耐药和躲避人体免疫系统攻击的重要手段之一。藻酸盐是生物被膜的重要组成成分,在生物被膜病的发病机制中有重要作用。氧疗是临床上常用的治疗方法,目前还没有关于高氧如何影响铜绿假单胞菌产生生物被膜的报道。密度感应系统是细菌协调群体生物学效应的一种有效手段,对于细菌毒力、耐药性等方面有重要影响,但是否在生成生物被膜这种群体行为中起调控作用目前也争议颇多。Ⅲ型分泌系统是铜绿假单胞菌主要的毒力因素之一,在急性感染中发挥重要作用,对于Ⅲ型分泌系统和生物被膜形成这两种生物学行为的关系学术界也有一些分歧。目的:观察氧环境变化对铜绿假单胞菌产生生物被膜及藻酸盐的影响,并探讨密度感应系统中Las系统和Rhl系统在生物被膜调控中的作用、以及Ⅲ型分泌系统表达和生物被膜形成的相互关系。方法:1.随机扩增DNA多态性基因分型法对23株铜绿假单胞菌临床株进行基因型鉴定,以区别是否有来源于同一克隆的菌株。2.23株基因型不同的铜绿假单胞菌临床株分别在无氧（0%氧浓度）、低氧（10%）、正常氧（20%）、高氧（30%、40%、50%、60%）七个不同的氧浓度下连续培养3天。用结晶紫染色法检测生物被膜产生量;对-羟基联苯法测定藻酸盐产生量。3.硝酸银染色法观察标准菌株ATCC27853在不同氧浓度环境下产胞外多糖的时间窗。4.观察ATCC27853在不同氧浓度环境下生长曲线的差异。5.采用实时定量PCR测定23株临床菌株在不同氧浓度环境下密度感应系统中信号分子合成酶调控基因LasⅠ和RhlⅠ的表达。6.Western blot方法观察23株临床菌株在不同氧浓度环境下分泌Ⅲ型分泌系统的代表毒素——胞外酶ExoS的情况。结果:1.基因分型显示23株菌株均能产生指纹图谱,分型率为100%。根据所得DNA片段数目及大小对铜绿假单胞菌菌株进行相似度比较,当使用随机引物A时,菌株1、3、6、20、22的DNA扩增条带相似,菌株4和23、8和21分别相似;其余菌株条带均不相同;再采用引物B对菌株1、3、4、6、8、20、21、22、23 DNA进行随机扩增,结果显示扩增条带均不相同。2.检测23株临床株分别在七种氧浓度环境下培养3天的生物被膜产生量,结果表明在氧浓度为50%时生物被膜产生量达到最高值（4.05 OD/mg/ml）,趋势性分析表明随着氧浓度的升高生物被膜产生量逐渐上升,相关性分析显示生物被膜产生量与氧浓度成正相关,R为0.455,P为0.000。3.测定23株临床株分别在七种氧浓度环境下培养3天的藻酸盐生成量,结果表明藻酸盐产生量是在氧浓度为60%的条件下达到最高值（85.22 ug/mg蛋白）,趋势性分析表明随着氧浓度的升高藻酸盐产生量逐渐上升,相关性分析显示藻酸盐产生量与氧浓度成正相关,R为0.367,P为0.000。4.银染法观察ATCC27853产生胞外多糖的时间窗,结果显示在氧浓度分别为40%、50%、60%时,菌株培养一小时即可出现胞外多糖;氧浓度分别为20%、30%时,菌株需培养2小时以上才出现胞外多糖;氧浓度为10%时,胞外多糖最早出现时间为4小时;无氧条件下,菌株培养8小时出现胞外多糖。5.ATCC27853生长曲线结果显示当氧浓度分别为0%、10%、20%时,菌株培养3小时开始由延迟期进入对数生长期;氧浓度为30%时,培养2小时进入对数生长期;氧浓度为40%、50%、60%时,菌株培养1小时即进入对数生长期。6.实时定量PCR结果显示相关性分析未见LasⅠ、RhlⅠ的表达和氧浓度（R分别为0.025和-0.044,P大于0.05）、对应菌株生物被膜产生量（R分别为0.001和0.11,P大于0.05）、藻酸盐产生量（R分别为0.029和0.193,P大于0.05）有统计学意义。7.Western blot结果表明菌株1、2、3、4、5、7、8、9、10、15、16、19、23共13株菌在氧浓度为20%条件下分泌胞外酶ExoS;当氧浓度为10%时,只有菌株15、16能够分泌ExoS;当氧浓度为30%时,菌株1、2、4、5、9、10、15能够分泌ExoS;氧浓度为0%、40%、50%、60%的条件下均未见菌株分泌ExoS。结论:1.铜绿假单胞菌在高氧环境下更容易产生生物被膜,且随着环境氧浓度的升高,生物被膜和藻酸盐产生量增加,表明高氧促进了铜绿假单胞菌产生生物被膜的能力,从而有利于铜绿假单胞菌在人体内的耐药和寄植,不利于肌体对病原菌的清除和抗生素杀菌作用的发挥,所以针对有铜绿假单胞菌感染高危因素的患者应该避免过高浓度的氧疗。2.在不同氧浓度环境下虽然铜绿假单胞菌产生生物被膜的能力有显著差异,但是生物被膜形成的早期密度感应系统中Las系统和Rhl系统关键基因表达无明显趋势性变化,因此Las系统和Rhl系统可能在生物被膜形成早期阶段因为菌群数量处于低水平而未参与生物被膜的调控过程。3.随着氧浓度的升高铜绿假单胞菌产生生物被膜增多,但是Ⅲ型分泌系统的代表毒素胞外酶ExoS分泌下调,表明铜绿假单胞菌生物被膜产生增多的同时Ⅲ型分泌系统的表达下调,侵袭力下降。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 一、材料
• 1、细菌菌株
• 2、主要试剂与试剂盒
• 二、主要实验仪器与实验设备
• 三、实验方法
• 1、随机扩增DNA多态性基因分型法
• 2、不同氧浓度环境下菌株培养
• 3、考马斯亮兰法测定被膜菌总蛋白量
• 4、结晶紫染色法检测生物被膜生成量
• 5、对-羟基联苯法检测藻酸盐产生量
• 6、银染色法观察不同氧浓度下菌株ATCC27853胞外多糖产生的时间窗
• 7、菌株ATCC27853在不同氧浓度条件下的生长曲线
• 8、荧光实时定量PCR观察不同氧浓度对LasI、RhlI、aIgU表达的影响
• 9、Western blot观察不同氧浓度对铜绿假单胞菌分泌胞外酶Exos的影响
• 四、统计分析
• 结果
• 一、随机扩增DNA多态性基因分型
• 二、不同氧浓度条件下铜绿假单胞菌生物被膜产生量
• 三、不同氧浓度条件下铜绿假单胞菌藻酸盐产生量
• 四、不同氧浓度条件下ATCC27853产生胞外多糖时间窗的差异
• 五、不同氧浓度条件下ATCC27853生长曲线的差异
• 六、实时定量检测不同氧浓度对LasI、RhlI、aIgU表达的影响
• 七、Western blot观察不同氧浓度对铜绿假单胞菌分泌胞外酶Exos的影响
• 讨论
• 一、随机扩增DNA多态性基因分型
• 二、氧浓度变化对铜绿假单胞菌生物被膜和藻酸盐生成的影响
• 三、氧浓度变化对藻酸盐正向调控基因aIgU表达的影响
• 四、硝酸银染色法观察不同氧浓度条件下胞外多糖生成的时间窗
• 五、不同氧浓度条件下ATCC27853生长曲线的差异
• 六、实时定量PCR观察氧浓度变化对LasI、RhlI表达的调控
• 七、Western blot观察不同氧浓度对铜绿假单胞菌分泌胞外酶Exos的影响
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词汇表
• 综述1
• 综述2
• 个人简历
• 致谢