肌肉抑制素基因工程疫苗原型的研究

论文题目: 肌肉抑制素基因工程疫苗原型的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生理学

作者: 马毅

导师: 陈永福,安晓荣

关键词: 肌肉抑制素,疫苗,多克隆抗体,乙肝核心抗原,骨骼肌,出生重,甲状腺素

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 肌肉抑制素(Myostatin,MSTN)特异性表达于肌肉组织,属于TGF-β超家族,是调控肌肉生长和发育的最重要的负调控因子,并同多种疾病有关。为获得MSTN蛋白,制备多克隆抗体,深入了解MSTN基因的调控机理,将MSTN基因片段克隆入组氨酸标签融合的表达载体pET-30a-c(+)中,IPTG诱导,利用金属螯合亲和层析(MCAC)进行纯化,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度与含量;免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting印迹检测抗体特异性。经表达形式分析证明,融合蛋白大部分为包涵体,薄层扫描分析表明纯化蛋白纯度可达90%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5mg/ml。抗血清效价可达1:250000以上,Westernblotting印迹检测证明抗体特异性良好。结论:经诱导表达及纯化制备出纯度较高的MSTN蛋白产物,并获得高效价特异性良好的多克隆抗体。 MSTN由骨骼肌表达进入血液以后,以自分泌或旁分泌的方式作用于骨骼肌,抑制骨骼肌的发育,而阻断MSTN作用途径可以显著增强肌肉发育。为探讨利用重组MSTN蛋白阻断体内MSTN作用途径,增强肌肉发育的可能性,本研究在体外成功表达并纯化了MSTN蛋白的基础上,将纯化后的MSTN蛋白同佐剂充分混合后,免疫雌性昆明白小鼠。第三次加强免疫后第三天同雄鼠合笼。研究结果表明,免疫后对照组和实验组母鼠体重差异不显著;在妊娠后期,两组之间体重出现差异,而分娩后,这种差异消失。仔鼠出生重在两处理组中差异极显著,实验组仔鼠出生重较对照组增加25.8%左右,但在生长阶段,两组间体重差异有逐渐减少的趋势。结论:应用重组MSTN蛋白免疫母鼠可以显著提高初生仔鼠体重。 应用重组MSTN蛋白免疫小鼠可以诱导体内免疫反应,但由于MSTN在高等动物中高度保守,而且MSTN分子量较小,因而其抗原性也相应较弱。而乙肝核心抗原是重要的载体蛋白,具有很强的免疫原性,能以T细胞依赖和T细胞非依赖作用方式产生免疫反应,并显著增强其融合蛋白的抗原性。为进一步增强MSTN的抗原性,提高疫苗的免疫效果,本研究利用PCR方法获得了MSTN羧端片段,并将其分别与乙肝核心抗原的氨端、羧端或中间融合,构建了三个重组融合表达克隆:pET-30a-c(+)-SM/HBcAg(N)、pET-30a-c(+)-SM/HBcAg(C)和pE7-30a-c(+)-SM/HBcAg(M),并经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中实现了表达。利用金属螯合亲和层析(MCAC)进行纯化。本实验结果为进一步探讨MSTN同HBcAg的最佳融合位点,增强MSTN的免役原性奠定了基础。 MSTN对骨骼肌的分化具有重要作用,包括雄激素等多种物质可通过调节MSTN的表达而影响肌肉的发育。而甲状腺素对骨骼肌的发育也具有重要作用,为此,有必要阐明甲状腺素同MSTN的关系,为进一步提高疫苗的作用效果奠定基础。本研究以雄性成年Wistar大鼠为研究对象,探讨了不同甲状腺素水平对大鼠骨骼肌中肌肉抑制素表达的影响。方法:连续14日腹腔注射L-甲状腺素(20mg/100g体重),制备高甲大鼠模型;以0.04%甲巯咪矬连续饲喂14日,制备低甲大鼠模型;以相同数量大鼠正常饲养,作为对照组。药物处理完毕后,分别以荧光定量实时PCR和Western blotting为检测方法,检测大鼠骨骼肌中肌肉抑制素在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果表明:在高甲状态下,大鼠骨骼肌中肌肉抑制素在mRNA和蛋白水平的表达均有显著升高;而在低甲状态下其mRNA表达水平和蛋白表达水平也有所增高,但同高甲组相比增高程度稍低。

论文目录:

摘要

Abstract

第一篇 文献综述

第一章 肌肉抑制素调节肌肉质量

1 肌肉抑制素的发现和其缺陷型动物的表型

2 MSTN的生物合成和其前体的调节

3 MSTN的信号通路

4 细胞和组织对MSTN信号的反应

5 临床应用

6 结论

第二章 现代疫苗研究概况

1 疫苗概念的产生及其背景

1.1 从牛痘的发明看疫苗概念的诞生

1.2 疫苗的种类

1.3 疫苗的基本成分、性质和特征

1.4 疫苗的应用

2 疫苗的技术发展

2.1 免疫原的技术发展

2.2 佐剂的技术发展

2.3 免疫途径的技术进展

2.4 联合免疫的进展

2.5 疫苗生产和使用管理的进展

3 疫苗的发展前景

3.1 联合疫苗

3.2 治疗性疫苗

3.3 通过食物摄取的疫苗和个性化疫苗

3.4 其他疫苗

4 乙肝核心抗原与基因因工程肽苗研究进展

4.1 HBcAg的分子生物学特征

4.2 HBcAg与外源抗原决定簇的融合及融合蛋白的特性

4.3 展望

第三章 甲状腺素调控的脊椎动物肌肉分化：myoD基因家族的作用

1 骨骼肌分化

2 MyoD基因家族的螺旋-环-螺旋蛋白调控的肌细胞生成

3 甲状腺营养对骨骼肌的影响

4 甲状腺素活动的位点和机制

5 类固醇受体在肌肉中的表达

6 甲状腺素活动调控的孤儿受体

7 甲状腺素和类维生素A类对于肌浆蛋白转录的调控

8 TR和AP-1(c-fos：c-jun)在肌肉中的拮抗

9 T3调节机制

10 总结

第四章 甲状腺素的基因调控

1 TR作用中配体结合区的功能

2 由T3介导的基因激活辅激活因子的作用

3 辅阻遏物的作用

4 由T3导致的基因表达抑制

第二篇 研究论文

第五章 肌肉抑制素的克隆，表达及其多抗血清的制备

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 主要设备

1.3 实验试剂及其配制：

1.4 实验方法

2 实验结果

2.1 原核表达载体的构建

2.2 重组质粒的高效表达及其蛋白的纯化

2.3 多抗血清的制备及其鉴定

3 讨论

第六章 应用重组MSTN蛋白免疫母鼠提高初生仔鼠体重的研究

1 实验材料与方法

1.1 材料与实验动物

1.2 主要设备

1.3 实验试剂及其配制

1.4 抗原的准备

1.5 实验动物

1.6 动物免疫方案

1.7 抗体滴度的测定

2 数据统计

3 实验结果

3.1 抗原的制备

3.2 免疫对母鼠的影响

3.3 免疫对仔鼠体重的影响

4 讨论

第七章 应用乙肝核心抗原(HBcAg)融合蛋白增强MSTN免疫原性的研究

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.2 主要设备、实验试剂及其配制

1.3 实验方法

2 实验结果

2.1 原核表达载体的构建

2.2 重组质粒的高效表达及其蛋白的纯化

3 讨论

第八章 不同甲状腺素水平对大鼠骨骼肌中MSTN基因表达的影响

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验动物

1.3 血液总T4测量

1.4 MSTN转录水平检测

1.5 Western blotting

2 数据统计

3 实验结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录

作者简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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• [2].猪肌生成抑制素cDNA的克隆、表达及其组织器官表达谱的研究[D]. 李慎涛.中国人民解放军军需大学2001
• [3].脂质体介导抑制素基因转染对牛卵泡细胞及胚胎发育的影响及机制研究[D]. 耿利英.华中农业大学2008
• [4].SPATA2基因敲除小鼠模型的建立及其睾丸相关表型和机理的研究[D]. 赵洁.中国农业大学2017

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