蚂蟥生长繁殖习性及其遗传多样性分子标记研究

论文摘要

药材水蛭为蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥品,是常用的活血化瘀药。目前心血管疾病给人类健康造成的危害已经越来越大,并已成为人类死亡的第一杀手,而以水蛭为主要原料的中成药产品有望成为这一顽症的克星,并且其抗炎作用可在饲料添加剂中进行大力开发应用。因此水蛭已成为中西药及饲料工业不可缺少的原料,且随着社会发展及其相关产品的开发,其需求量仍将快速增长,而野生资源却日益枯竭致使供需矛盾非常突出。近几年,水蛭已成为世界性的紧俏中药材之一。1984年水蛭被列入动物保护国际红皮书。保护现有的蚂蟥野生资源已成当务之急,为此蚂蟥种质资源亟待整理和评价,以便为蚂蟥核心种质资源库的建立提供有力保障。本研究首先从蚂蟥内脏结构、皮肤表皮细胞类型的分布等形态学研究开始,进一步研究了蚂蟥的生理、生长、繁殖习性和药材中农残、重金属的积累,并对不同炮制品、不同种质的蚂蟥的内在质量进行系统的评价。在对其生理、生长、繁殖习性研究的基础上,收集了我国蚂蟥分布区部分种质资源,同时引入4个水蛭H.nipponica种群作为参照,在分子水平分析了蚂蟥遗传多样性,了解其群体遗传结构和多态性水平,并进行了类群的划分,为蚂蟥和水蛭的资源保护利用策略和人工选育提供有力的理论依据。其次,采用两种方法开发了蚂蟥的微卫星序列,并分析了其特点,为SSR分子标记在蚂蟥遗传多样性研究中的应用和蚂蟥种质资源的鉴定奠定了基础。具体研究内容和结果如下:1.蚂蟥生长繁殖习性及药材质量评价研究（1）应用组织石蜡切片和显微摄影方法,对蚂蟥内脏器官,包括口、咽、食管、嗉囊、肠、直肠、侧盲囊、精巢、储精囊、输精管、射精球、前列腺、皮肤等进行解剖观察分析。明确了蚂蟥的消化系统、生殖系统器官和皮肤的组织结构和作用,皮肤黏液细胞的类型与分布。为进一步研究蚂蟥的生长、繁殖习性和人工养殖及种质鉴别提供参考依据。（2）应用呼吸室法研究了蚂蟥的耗氧率、耗氧量和窒息点。结果表明平均体重为10g的蚂蟥,15～35℃变温条件下耗氧率变化在0.049～0.094mg·g-1·h-1之间,耗氧量在0.44～0.67mg·p-1·h-1之间,窒息点为0.90～1.51mg·L-1,20℃条件下耗氧率为0.044～0.058mg·g-1·h-1,耗氧量为0.19～0.77mg·p-1·h-1,窒息点为1.40～1.57mg·L-1。说明蚂蟥的耗氧率随温度的升高而上升,窒息点随温度的升高而降低,体重与耗氧率呈负相关,与耗氧量呈正相关,白昼和夜晚耗氧率的差异不大。（3）研究了在不同温度条件下不同体重蚂蟥生长摄食情况,以及蚂蟥在24h内的摄食期律。结果表明蚂蟥生长的适宜温度是15～25℃,其饱食量随着体重增大和温度的升高而增加,摄食率随个体增大而降低,在24h之内蚂蟥有两个摄食高峰。（4）在不同温度、体重条件下观察了蚂蟥产卵和孵化习性。结果表明,蚂蟥产卵和孵化的最适温度为25℃,产卵的最佳体重为20g左右;温度能影响蚂蟥产卵前后的体重,而体重大小对产卵前后体重变化影响不明显;当卵重在0.1～2.0g之间时与孵出量成正比,当卵重大于2.0g时孵出量反而有所下降。（5）采用原子吸收分光光度计、原子荧光分光光度计和气相色谱仪对蚂蟥、基地土壤和养殖用水的重金属与农药残留进行了比较分析。结果表明除蚂蟥药材中铅超出国家现行有关标准外,蚂蟥药材、养殖基地土壤和养殖用水六六六、DDT和重金属残留各项指标均符合国家规定标准。建议今后在制订国家有关标准时,将类似蚂蟥类等动物的安全限量单独列出。（6）采用《药典》一部（2005版）的方法测定了野生和人工养殖蚂蟥不同炮制品的水分、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等指标,用电感耦合等离子体发射光谱仪测定了铁、锌、铜、铬、铅、镉、汞等元素,比较了野生和人工养殖蚂蟥不同炮制品的内在质量。结果表明,水分:人工养殖与野生炮制品两者之间差异不显著（P＞0.05）;总灰分:滑石粉烫炮制品最高,与其它炮制品差异显著（P＜0.05）;酸不溶性灰分:滑石粉烫炮制品最高,与其他炮制品差异不显著（P＞0.05）;醇溶性浸出物:野生炮制品与人工养殖炮制品差异显著（P＜0.05）;抗凝血酶活性:野生和人工养殖生晒品均达到药典标准,且二者之间差异不显著（P＞0.05）;人工养殖及野生蚂蟥不同炮制品中除铅超标外,其余金属元素含量均符合国家标准。（7）参考《药典》一部（2005版）测定了不同种群蚂蟥的水分、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等指标,采用高效液相色谱法测定了其黄嘌呤,次黄嘌呤。结果表明南京人工养殖种群在水分、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性、黄嘌呤、次黄嘌呤等成分上均相对高于其他种群。2.利用分子标记技术分析我国蚂蟥种质资源遗传多样性（1）以全国蚂蟥主要分布区的8个省15份种质225个样本进行遗传多样性分析。利用RAPD标记技术分析,结果表明在物种水平上,多态位点百分率（PPL）为99.66%,Nei’S基因多样性指数（He）为0.3599。种群水平上的多态位点百分率在30.30%～56.06%之间,平均为44.14%,最高为安徽马鞍山,其次为江苏溧阳,最低为南京人工养殖。群体间遗传分化系数(GST)为0.5539,种群间基因流（Nm）为0.4028。数据显示种群间分化较大,种群内存在一定程度变异。聚类分析显示,当相似系数为0.80时,可将15份材料分为8个类群,其中广西桂林、广东广州、云南大理、安徽马鞍山四个医蛭种群与其它大部分蚂蟥种群相似性较低。（2）利用ISSR分子标记技术分析了蚂蟥遗传多样性,结果表明,在物种水平上,PPL为99.56%,He为0.3490。种群水平上的PPL在25.00%～53.95%之间,平均为37.73%,最高为广西桂林,其次为广东广州,最低为江苏南京人工养殖。GST为0.5730,Nm为0.3727。结果也表明蚂蟥种群间存在较高水平遗传分化,种群内也存在一定的遗传变异。聚类分析表明,当相似系数为0.78时,可将供试的15个蚂蟥种群分为5个类群。（3）SRAP标记是一种新型技术,本文分析SRAP标记在蚂蟥遗传多样性研究上的适用性。结果表明在物种水平上,PPL为99.02%,He为0.3687。种群水平上PPL在31.69%～58.86%之间,平均为50.59%,最高为江西乐安,其次为江苏溧阳,最低为江苏南京人工养殖。GST为0.4699,Nm为0.5641。聚类分析显示,当相似系数为0.82时,可将15个种群分为6个类群。将SRAP标记结果同RAPD和ISSR结果分析比较,认为该新型标记可以用于蚂蟥遗传多样性研究。（4）通过测定蚂蟥核糖体ITS碱基序列,分析其特点,了解种内变异类型。结果得到我国蚂蟥主要的14个种群14个样本rDNA中的ITS完全序列。ITS长度为857～863bp。ITS碱基频率差异显著,ITS较为保守。根据两者序列以邻接法建立分子系统发生树,表明蚂蟥种内至少存在3个变异类型。结合RAPD、ISSR和SRAP三种分子标记的研究结果,可将供试材料分为三个等级加以保护和利用。3.蚂蟥微卫星（SSR）的开发SSR标记具有共显性特点,开发蚂蟥微卫星对于遗传多样性研究具有重要意义。通过分析评价两种有代表性的SSR标记开发方法,为微卫星开发方法的选择提供参考信息。在现有方法基础上提出蚂蟥微卫星序列开发的两种策略。（1）根据链亲和素磁珠和生物素特异结合的特性,将微卫星探针5’端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的蚂蟥基因组DNA酶切片段杂交,洗脱未杂交DNA片断后,建立微卫星文库。以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,产物直接克隆,经菌液PCR筛选后测序分析。（2）将特异接头连接到限制性内切酶消化的基因组DNA上,以此为模板用简并引物抑制性PCR获得SSR文库,克隆后经过两次菌液PCR筛选进行测序分析。结果表明,这两种方法可以快速、高效地开发出微卫星序列。（3）结合前面从基因组DNA中已开发的微卫星序列,分析了蚂蟥SSR特点。结果发现二核苷酸重复类型在蚂蟥SSR占绝对优势,出现频率近93%,二核苷酸重复中以（AC）n重复基元为主,达53.33%。此外,对SSR位点总共设计了14对引物,其中11对经检测有效可用于蚂蟥遗传多样性分析。

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摘要

ABSTRACT

缩略语表

第一章文献综述

第一节蚂蟥、水蛭研究概述

1 历史文献考证

2 现代研究

3 资源分布及分类

4 药理研究

4.1 抗凝血作用

4.2 抗血栓作用

4.3 对心、脑血管系统的改善作用

4.4 对血液流变学及造血功能的的影响

4.5 抗炎作用

4.6 抗肿瘤作用

4.7 降血脂作用

4.8 抗早孕作用

4.9 保肾作用

4.10 抗增殖作用

4.11 对眼科疾病的治疗作用

5 毒副作用

6 临床应用

6.1 治疗心、脑血管疾病

6.2 治疗呼吸系统疾病

6.3 治疗肾病

6.4 骨伤科临床中的应用

6.5 治疗妇科及男性泌尿系统疾病

7 炮制研究

7.1 古代炮制历史文献考证

7.2 现代炮制方法

第二节 DNA分子标记在水生动物遗传研究中的应用

1 分子遗传标记技术概述

2 分子遗传标记技术在水产动物遗传研究中的应用

2.1 RFLP标记技术

2.2 RAPD标记技术

2.3 AFLP标记技术

2.4 微卫星（SSR）分子标记

2.5 ISSR分子标记

2.6 SRAP分子标记

2.7 DNA测序技术

第三节微卫星及其开发策略

1 微卫星概况

1.1 微卫星的分类与命名

1.2 微卫星的丰度

1.3 微卫星引物及保守性

2 SSR开发研究进展

2.1 从数据库或有关文章直接查询本物种引物

2.2 从相近物种获得微卫星引物

2.3 采取富集步骤的SSR标记开发策略

2.4 省略筛库法

2.5 从EST中发展SSR标记

第二章蚂蟥生长繁殖习性及药材质量评价研究

第一节蚂蟥内脏器官和皮肤的组织结构观察

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 消化系统

2.2 生殖系统

2.3 蚂蟥皮肤中黏液细胞的类型

2.4 不同黏液细胞的分布

3 讨论

3.1 制片过程总结

3.2 对组织结构的讨论

3.3 皮肤的作用

3.4 蚂蟥皮肤及结构的形态

3.5 蛭类与鱼类黏液细胞的比较

第二节蚂蟥耗氧率与窒息点研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 不同水温条件蚂蟥的耗氧率和耗氧量

2.2 不同体重的蚂蟥的耗氧率和耗氧量

2.3 25℃条件下蚂蟥昼夜耗氧率的变化

2.4 不同水温条件蚂蟥的窒息点

2.5 不同体重条件蚂蟥的窒息点

3 讨论

3.1 不同水温对蚂蟥耗氧率的影响

3.2 25℃条件下蚂蟥耗氧率的昼夜变化

3.3 20℃条件下体重对蚂蟥耗氧率及耗氧量的影响

3.4 蚂蟥临界窒息点与水温、体重的关系

第三节温度对蚂蟥生长及摄食规律影响的研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 蚂蟥摄食规律的研究

2 结果与分析

2.1 温度对蚂蟥生长的影响

2.2 蚂蟥饱食量及摄食率的研究

2.3 蚂蟥摄食规律的研究

3 讨论

3.1 温度对蚂蟥摄食的影响

3.2 体重大小对饱食量和摄食率的影响

3.3 体重大小对饱食量和摄食率的影响

3.4 蚂蟥摄食时间和饱食量在生产中的意义

第四节温度和体重对蚂蟥人工繁殖影响的研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 温度对蚂蟥产卵及产卵后体重变化的影响

2.2 体重对蚂蟥产卵及产卵后体重变化的影响

2.3 卵重与孵化的关系

2.4 温度对孵化的影响

3 讨论

3.1 温度对产卵量的影响

3.2 体重对产卵量的影响

3.3 温度对孵化的影响

3.4 卵重与孵化的关系

3.5 温度与体重对蚂蟥产卵后体重的影响

第五节蚂蟥及其养殖基地农药与重金属残留分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 农药残留含量比较

2.2 重金属残留量比较

3 讨论

3.1 基地环境和药材的安全性

3.2 土壤、养殖用水的有机氯对药材农药残留的影响

3.3 土壤、灌溉用水的重金属残留对药材污染情况

第六节野生和人工养殖蚂蟥不同炮制品内在质量的比较研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 野生和人工养殖蚂蟥不同炮制品中水分、灰分、浸出物含量和抗凝血酶活性的比较

2.2 炮制方法对野生、养殖蚂蟥无机元素含量的影响

3 讨论

3.1 野生和人工养殖蚂蟥内在质量的比较

3.2 不同炮制方法对野生和人工养殖蚂蟥内在质量影响的比较

第七节不同种群蚂蟥内在质量的比较

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 不同种群蚂蟥水分、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性比较

2.2 黄嘌呤、次黄嘌呤线性范围考察

2.3 精密度实验

2.4 黄嘌呤、次黄嘌呤含量的测定

3 分析与讨论

3.1 醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分含量及抗凝血酶活性分析

3.2 黄嘌呤、次黄嘌呤分析

第三章蚂蟥遗传多样性分子标记

第一节基于RAPD分子标记的蚂蟥遗传多样性分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 总DNA电泳结果

2.2 RAPD反应体系及引物确立

2.3 种群和物种水平遗传多样性

2.4 种群和物种水平遗传多样性

2.5 聚类分析

2.6 主坐标分析

3 讨论

3.1 种群和物种水平遗传多样性

3.2 种群遗传分化

3.3 主坐标分析

第二节基于ISSR分子标记的蚂蟥遗传多样性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 ISSR反应体系及引物确立

2.2 种群和物种水平遗传多样性

2.3 种群间遗传分化程度比较分析

2.4 聚类分析

2.5 主坐标分析

3 讨论

3.1 蚂蟥的遗传多样性

3.2 蚂蟥种群遗传分化

3.3 蚂蟥种群聚类分析

第三节基于SRAP分子标记的蚂蟥遗传多样性分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 SRAP反应体系及引物确立

2.2 种群和物种水平遗传多样性

2.3 种群间遗传分化程度比较分析

2.4 聚类分析

2.5 主坐标分析

3 讨论

3.1 蚂蟥种群遗传结构及遗传变异分析

3.2 蚂蟥种群遗传分化

3.3 蚂蟥种群聚类分析

第四节 RAPD、ISSR与SRAP数据综合分析

1 材料和方法

1.1 数据来源

1.2 数据处理及分析方法

2 结果与分析

2.1 RAPD标记、TSSR标记和SRAP标记相关性分析

2.2 RAPD标记、ISSR标记和SRAP标记比较分析

2.3 聚类分析

3 讨论

3.1 RAPD、ISSR和SRAP标记效率

3.2 种群聚类分析

第五节蚂蟥ITS测序分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 序列测定结果

2.2 蚂蟥ITS长度和碱基频率分析

2.3 ITS碱基序列的差异分析

2.4 重建系统树

2.5 ITS序列变异与地理分布关系

3 讨论

3.1 ITS序列鉴别蚂蟥

3.2 蚂蟥ITS序列变异与同步进化

3.3 蚂蟥资源保护利用策略

第四章蚂蟥微卫星序列的开发

第一节磁珠富集法开发蚂蟥微卫星序列

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 蚂蟥总DNA提取结果

2.2 SSR序列的获得

2.3 克隆测序结果分析

3 分析与讨论

第二节 SAM改良法开发蚂蟥微卫星序列

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 SAM抑制性扩增

2.2 PCR产物克隆转化

2.3 菌液PCR扩增检测

2.4 克隆测序结果分析

3 分析与讨论

3.1 限制性内切酶的选择与接头引物设计

3.2 改进SAM法开发SSR原理

3.3 改进SAM法开发SSR的效率

第三节蚂蟥微卫星序列信息分析及引物设计与验证

1 材料与方法

1.1 序列来源

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 SSR发生的特点

2.2 蚂蟥SSR引物设计

2.3 蚂蟥SSR引物多态性检测

3 讨论

全文结论

论文创新点及不足之处

参考文献

附录

登录Genebank的部分序列

（1） ITS序列EU622928

（2）微卫星序列EU547725

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