产EPA土壤真菌的高通量筛选及发酵调控研究

论文摘要

二十碳五烯酸（5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid,简称EPA）属于ω-3系列多不饱和脂肪酸,在防治心血管疾病、抗癌、抗炎等方面具有重要作用。利用微生物发酵生产EPA具有周期短,不受原料、气候、产地的限制,易于规模化生产等优点,是近年来国内外的研究热点。本研究首先建立了产EPA土壤真菌的高通量筛选方法,即以EPA合成途径的关键酶基因作为分子标记,基于PCR扩增进行定向初筛,再对初筛所得菌株的油脂成分进行GC-MS检测,最终确定EPA高产菌株。筛选所得菌株RBB-2和RBB-5油脂中EPA含量分别为6.95%和9.90%,EPA产量分别为215.81 mg/L和263.80 mg/L。该方法简化了筛选过程,极大地提高了筛选效率。从形态特征、生理生化特征以及18S rRNA序列分析等多方面对EPA产量较高的菌株RBB-5进行分类鉴定,结果表明,菌株RBB-5的形态和生理特征与腐霉属的特性相同,且其18S rRNA序列与Pythium splendens 117的18S rRNA序列相似度为99%,因此,将其归属于华丽腐霉,并命名为Pythium splendens RBB-5。通过研究影响EPA合成的主要因素,结合发酵过程中菌体生长、油脂积累、EPA合成以及溶氧变化的规律,确立了优化的发酵调控方法,即25°C发酵至96 h,程序降温至15°C;0-72 h调节通气比为0.8 vvm,72-168 h调节通气比为1.2 vvm;发酵至72 h时,向培养基中添加60 g/L豆芽汁;继续发酵至168 h。在此条件下培养的菌体,其生物量为26.20 g/L,油脂含量为16.08%,油脂中EPA含量为22.87%,EPA产量达963.50 mg/L。采用根癌农杆菌LBA4404介导,以华丽腐霉RBB-5孢子为受体材料,对影响转化效率的因素,如转化过程中农杆菌的浓度、共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度、共培养时间和共培养温度等进行分析,建立并优化了农杆菌介导的华丽腐霉RBB-5遗传转化体系,为构建EPA高产基因工程菌奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 EPA的结构功能及应用
• 1.2 EPA的资源开发研究
• 1.3 EPA合成途径与相关基因研究
• 1.4 真菌发酵生产EPA研究进展
• 1.5 本研究的目的、意义及主要内容
• 2 产EPA土壤真菌的高通量筛选
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 小结
• 3 EPA高产菌株的鉴定
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 小结
• 4 EPA发酵调控研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 小结
• 5 农杆菌介导转化体系的建立与优化
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.4 小结
• 6 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 创新之处
• 6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 攻读硕士期间发表及拟发表论文