亚毒性微小剂量方法对卡铂耐药性的鉴定、预测及其机制研究

论文摘要

目的：铂类药物广泛应用于临床抗多种类型肿瘤的化学治疗。其中,卡铂属于第二代铂类药物,以其低毒性且与顺铂具有几乎相同效能谱的优势,成为目前临床化疗中最为常用的抗肿瘤药物之一。以铂药为基础的联合化疗是非小细胞肺癌及膀胱移行细胞癌的标准疗法。然而,化学耐药性的存在使部分患者的病情难以从化疗中得到改善；同时,在化疗前对药物化学耐药性的鉴定未能达到医疗需要。DNA是铂药抗肿瘤作用的主要靶点,DNA损伤即Pt-DNA加合物形成,是肿瘤细胞对铂药化疗产生反应的关键环节。假设铂类药物诱导低水平DNA损伤可预测化学耐药性,即肿瘤细胞基因组DNA未形成或形成低水平的DNA损伤预示其对铂类药物具有潜在的治疗抵抗。加速质谱测定法（AMS）是检测碳-14超灵敏方法,当14C标记的卡铂诱导Pt-DNA单加合物形成时,带有14C的卡铂会与DNA共价结合。通过AMS检测基因组DNA上14C含量,可量化卡铂-DNA加合物水平。此外,检测某些相关参数,如药物摄取/排出、细胞内药物失活及DNA修复,可揭示化学耐药性的机制。超灵敏AMS可在患者或肿瘤细胞接受亚毒性微小剂量14C标记的卡铂时完成上述研究,以期建立亚毒性微小剂量方法对卡铂耐药的鉴定及预测。预测肿瘤对特定化疗方案的反应性实用性强,使个体化治疗达到最佳疗效,最小化毒副作用的危险率,避免有效治疗期的延误。本研究检测人肿瘤细胞系及肿瘤患者卡铂-DNA加合物形成及修复,以鉴定化学耐药性及探讨耐药性的潜在机制,为患者接受化学治疗前制定具有高度针对性的个体化治疗方案。方法及结果：本研究开展六种肺癌细胞系及五种膀胱癌细胞系的体外实验,采用AMS对放射性14C标记的卡铂亚毒性微小剂量与临床治疗剂量在不同时间点诱导的DNA单加合物水平及DNA修复水平进行检测,以及对二者相关性进行分析。结果显示,14C标记的卡铂微小剂量在放射性强度为50,000 dpm/ml、治疗剂量的1%用量时可诱导DNA损伤（治疗剂量卡铂的生理学靶标）,且两个剂量下诱导的DNA单加合物形成水平呈高度相关（r2=0.95,p<0.0001肺癌与膀胱癌）。MTT法检测肿瘤细胞对卡铂的耐药水平,并通过计算半数抑制浓度IC50加以反映；同时,通过比较每种细胞DNA单加合物形成水平与IC50的相关性,揭示DNA损伤程度与肿瘤细胞对卡铂耐药之间的相互关系。结果显示,经卡铂微小剂量与临床治疗剂量分别诱导的DNA单加合物水平（r2=0.77,p=0.022微小剂量;r2=0.83,p=0.011治疗剂量）及AUC（r2=0.77,p=0.022微小剂量；r2=0.83,p=0.011治疗剂量）与六种NSCLC细胞系IC50值呈直线相关,提示微小剂量卡铂诱导的DNA单加合物水平可潜在性鉴定及预测卡铂耐药性。经两个剂量分别诱导的DNA单加合物修复率与五种膀胱癌细胞系IC50值呈直线相关（r2=0.80,p=0.04微小剂量；r2=0.82,p=0.03治疗剂量）,提示DNA单加合物水平可潜在性鉴定膀胱癌细胞对卡铂耐药的部分机制。此外,采用电感耦合等离子体质谱测定法（ICP-MS）,检测五种膀胱癌细胞系经治疗剂量卡铂诱导DNA加合物中的总铂含量及其修复率,结果显示,ICP-MS检测结果与AMS检测单加合物水平呈直线相关（r2=0.85,p<0.0001）,提示卡铂诱导单加合物水平亦可替代DNA总加合物水平对膀胱癌卡铂耐药进行鉴定及预测。此外,采用实时定量PCR检测六种肺癌细胞系及五种膀胱癌细胞系中以铂药为基础的化疗效果指示剂ERCC1及RRM1 mRNA表达,结果表明,采用AMS检测微小剂量或治疗剂量诱导的Pt-DNA单加合物水平及其修复率明显优于ERCC1及RRM1 mRNA表达水平与卡铂耐药性之间的相关性。在分子水平探讨影响DNA损伤及铂药耐药的潜在机制。检测药物摄取/排出及细胞内药物失活深入探讨耐药机制。与铂药敏感细胞系H23比较,耐药细胞系A549的DNA损伤水平低、IC50高（p<0.001）,液体闪烁计数法（LSC）检测两种细胞系具有相同的药物吸收水平,而H23细胞表现出较强的药物外排能力,说明此机制不是两种细胞系耐药差异的影响因素。此外,细胞内谷胱甘肽（GSH）水平参与铂药在A549细胞内的失活作用。结果显示,A549细胞总GSH水平较H23高（p<0.001）,使用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂BSO抑制GSH的生物合成,明显增强A549细胞对卡铂的敏感性,即IC50降低（p<0.01）,单加合物水平升高（p<0.05）。研究中通过卡铂长期诱导获得膀胱癌5637耐药细胞,检测耐药细胞较亲代敏感细胞GSH水平增高（p<0.05）。探讨DNA修复机制是否参与铂药化学耐药性的形成。检测DNA修复方式核苷酸切除修复（NER）体系中的关键蛋白ERCC1。应用siRNA下调耐药细胞A549中该基因的表达,可明显升高DNA单加合物水平（p<0.01）及增强A549对卡铂的敏感性,即IC50降低（p<0.001）。此外,采用PCR阵列及Western blot检测5637亲代细胞及耐药细胞之间DNA修复基因的表达差异,耐药细胞MGMT mRNA及蛋白表达水平均明显升高（p<0.05）。提示多种潜在机制共同参与卡铂化学耐药性。为验证微小剂量方法在临床应用的可行性,本研究开展了在体实验。经小鼠及荷瘤裸鼠尾静脉注射微小剂量或治疗剂量卡铂（2或200mg/m2,其中14C标记的卡铂50,000dpm/g）,LSC检测血液样本14C含量,以计算药代动力学参数；AMS检测PBMC与荷瘤组织DNA单加合物水平。结果显示,卡铂微小剂量与治疗剂量的药代动力学相同,二者DNA单加合物水平呈直线相关（r2=0.94,p<0.001）,荷瘤组织DNA单加合物水平对卡铂耐药性的鉴定与体外实验结果一致,提示在体内亚毒性微小剂量卡铂亦是其治疗剂量理想的替代方式。基于上述结果,本研究首次开展了微小剂量临床0期试验。试验初期结果显示,四位肿瘤患者接受一亚毒性微小剂量卡铂（14C标记的卡铂为10×106dpm/kg,14C非标记的卡铂为临床治疗剂量1%用量）,半衰期为1.5-2h,与治疗剂量一致。PBMC中代表卡铂-DNA单加合物水平的14C信号较AMS检测的本底辐射数值高10～100倍,达到AMS有效检测范围。此微小剂量对患者无毒性作用,同时14C射线照射量低于一次腹部CT的0.2%,适合应用于后续的临床试验。结论：1.亚毒性微小剂量与临床治疗剂量卡铂的药代动力学相同。2.亚毒性微小剂量卡铂可诱导体外培养的肿瘤细胞、体内移植物肿瘤,以及小鼠及患者PBMC基因组DNA损伤。3.微小剂量与治疗剂量卡铂分别诱导的肿瘤细胞、荷瘤组织中DNA单加合物水平呈直线相关,可潜在鉴定及预测治疗剂量下DNA的损伤程度。4.卡铂诱导低水平的单加合物和（或）高DNA修复率与卡铂耐药性（IC50值）呈正相关,可潜在鉴定及预测其化学耐药性。5.DNA单加合物水平与总铂含量（即总加合物水平）的变化趋势呈直线相关,可反映总加合物对DNA的损伤程度。6.药物代谢、细胞内药物失活及DNA修复途径可不同程度影响Pt-DNA单加合物形成水平,进而影响卡铂耐药性。■

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词索引表
• 第1章 绪论
• 第1节 铂类药物的抗肿瘤作用机制
• 1 铂药的生物学靶标及其铂酸盐化
• 2 Pt-DNA加合物的形成对DNA功能的影响及结果
• 第2节 铂类药物的化学耐药性
• 1 药物在细胞内的蓄积
• 2 细胞内的解毒作用
• 3 DNA修复体系
• 4 DNA损伤耐受增强
• 5 细胞凋亡缺陷
• 第3节 微小剂量研究方法在生物医学领域中的应用
• 第2章 实验研究
• 实验1 亚毒性微小剂量卡铂对NSCLC细胞系耐药的鉴定及其机制
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 小结
• 实验2 毒性微小剂量卡铂对膀胱癌TCC细胞系耐药的鉴定及其机制
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 小结
• 实验3 毒性微小剂量方法鉴定及预测卡铂耐药性的在体实验
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 小结
• 第3章 讨论
• 第4章 结论
• 创新性总结
• 参考文献
• 附件
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢