小麦过敏原α-醇溶蛋白编码基因的分子克隆的研究

论文摘要

小麦被联合国粮食及农业组织（FAO,1995）认定为八大类食物过敏原之一,小麦过敏是一个不可忽视的食品安全问题,它多见于迟发性过敏反应,有较高的病患率和漏诊率,且并发症状比较多,严重影响着过敏患者的生活。随着我国加入WTO和国际上对食品安全要求的不断提高,在国际贸易中涉及的小麦过敏问题将给我国的面制品的生产发展带来严重的挑战。因此,在我国开展小麦过敏的研究具有重要的价值。小麦醇溶蛋白（gliadin）是乳糜泻的主要致病抗原,醇溶蛋白以多肽单链的形式存在,富含谷胺酰胺和脯氨酸,有α、β、γ、ω四个片段,这些蛋白的毒性已被肯定,对粘膜损害较大,其中以α片段为最甚。尽管提取小麦醇溶蛋白并不困难,但要从大量高度同源的这类蛋白混合物中提纯某种单个的蛋白却并非易事,而通过体外大量表达则可以解决这个问题。本研究的主要内容包括小麦过敏原α-gliadin基因的克隆及序列分析、α-gliadin的基因在原核系统中的表达、α-gliadin的B细胞抗原表位的预测。主要工作如下:1以小麦品种（郑麦9023）为实验对象,成功地提取了基因组DNA。通过TA克隆构建了克隆载体pMD19-T-α-gli,通过抗性及蓝白斑筛选,获得了阳性克隆子。阳性克隆子经过原位PCR、酶切及测序鉴定,结果表明含目的基因,证明载体构建正确。克隆出的目的基因的同源性检索分析表明,成功地克隆到正确的α-gliadin基因序列。2成功地构建了表达载体pGEX-4T-1-α-gli,并将其转化到受体菌E.coliBL21（DE3）pLysS中,PCR扩增和酶切分析显示构建正确。测序结果,表明插入片段大小、序列、位置、方向均正确。采用IPTG进行诱导,通过SDS-PAGE电泳检测,获得大小约为57kD的表达蛋白带,与理论估计值相符。采用1.0mmol/L的IPTG诱导表达7h时后,融合蛋白含量GST-α-gliadin达到菌体总蛋白33.6%左右。3采用生物信息软件和互联网服务器,预测了α-gliadin的二级结构和α-gliadin表面特性（亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原性指数）。结果显示,α-gliadin属于一种结构混合型蛋白,含有α-螺旋、β-片层、β-转角和无规则卷曲四种结构。经过亲水性方案、柔韧性方案、表面可及性方案、抗原性指数评估以及二级结构预测等综合考虑,α-gliadin的B细胞表位的区段可能位于8～21,33～55,68～113,184～194,213～235位氨基酸区域内或其附近,被预测的表位均含有β-转角或无规则卷曲结构。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 前言
• 1.2 食物过敏
• 1.2.1 食物过敏的概念
• 1.2.2 食物过敏机理
• 1.2.3 食物过敏的主要影响因素
• 1.2.4 主要过敏性食物
• 1.3 小麦过敏
• 1.3.1 小麦中的蛋白组成
• 1.3.2 小麦主要过敏原及其过敏性的研究概况
• 1.3.3 乳糜泻
• 1.4 小麦过敏原的检测方法
• 1.5 立题背景与研究内容
• 1.5.1 立题背景
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 A-醇溶蛋白基因的克隆及序列分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株、质粒
• 2.2.2 工具酶、分子量Marker及主要生化试剂
• 2.2.3 主要仪器与设备
• 2.2.4 PCR引物
• 2.2.5 常规培养基及溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 小麦种子基因组DNA的提取
• 2.3.2 用紫外分光光度计检测基因组DNA质量
• 2.3.3 琼脂糖电泳鉴定DNA
• 2.3.4 从基因组中扩增α-gliadin基因组
• 2.3.5 PCR产物的割胶回收纯化
• 2.3.6 目的基因的T/A克隆、筛选和鉴定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 小麦基因组DNA的提取
• 2.4.2 α-gliadin基因的PCR
• 2.4.3 重组克隆质粒pMD19-T-α-gli的构建
• 2.4.4 克隆重组质粒的鉴定
• 2.4.5 测序及同源性分析
• 2.4.6 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 A-醇溶蛋白的基因在原核系统中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株、质粒
• 3.2.2 工具酶、分子量Marker及主要生化试剂
• 3.2.3 主要仪器与设备
• 3.2.4 PCR引物
• 3.2.5 常规培养基及溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌株培养
• 3.3.2 高纯度质粒小量提取方法
• 3.3.3 质粒的限制性双酶切
• 3.3.4 回收酶切后的DNA片段
• 3.3.5 目的基因与载体的连接
• 3.3.6 大肠杆菌E.coliBL21（DE3）pLysS感受态细胞的制备
• 3.3.7 连接产物转化感受态细胞
• 3.3.8 表达载体pGEX-4T-1-α-gli的鉴定
• 3.3.9 目的基因的诱导表达及SDS-PAGE法检测表达蛋白
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 表达载体的构建
• 3.4.2 表达载体的鉴定
• 3.4.3 表达产物的SDS-PAGE检测分析
• 3.4.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 A-醇溶蛋白的B细胞抗原表位的预测
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 α-gliadin氨基酸序列
• 4.2.2 计算机分析软件及服务器
• 4.2.3 二级结构预测及分析
• 4.2.4 单因素预测
• 4.2.5 B细胞表位的确定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 α-gliadin的二级结构的预测
• 4.3.2 α-gliadin的亲水性预测
• 4.3.3 α-gliadin的表面可及性预测
• 4.3.4 α-gliadin的柔韧性预测
• 4.3.5 α-gliadin的抗原性指数预测
• 4.3.6 B细胞表位预测结果
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 简历及发表的论文