大鼠骨缺损对脂肪源干细胞BMP信号通路相关分子表达的影响

论文摘要

背景：原林教授提出的筋膜学“两系统理论”认为：人体由非特异性结缔组织筋膜支架所构成的支持与储备系统和被该筋膜支架所包绕的功能系统所构成。支持与储备系统以干细胞为核心,可为功能系统的更新提供细胞补充,并为功能系统的各种功能细胞的更新、代谢提供一个较为稳定的内部环境和干细胞源。疏松结缔组织是支持与储备系统重要的组成部分,其中的脂肪源干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）是机体重要的干细胞储备之一。支持与储备系统使生物维持较长的生命周期和维持机体稳定的内环境。疏松结缔组织中的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）构成了支持与储备系统的主要物质基础。该学说的“损伤修复机制”认为,机体在受外界刺激作用而损伤时,通过动员支持与储备系统（机体非特异性的结缔组织）中未分化的干细胞,经增殖,不断为功能系统提供源源不断的干细胞源,并分化成各种定向干细胞、进而分化成功能细胞来修复机体损伤,维持机体的稳定。有相关文献报道,在人体受到创伤时,间充质干细胞通过增殖、分化来修复损伤。骨损伤作为一种常见的创伤,可能具有相同或相似的损伤修复机制。ADSCs是目前干细胞的研究热点之一。作为一种新的MSCs,其具备了成体干细胞（Adult stem cells, ASCs）的特征,具有自我增殖和多向分化的能力。能在一定的条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞和神经细胞等。近期的研究发现,和骨髓干细胞（Bone marrow stem cell, BMSCs）相比,ADSCs具有取材手术小、可重复进行、酶消化分离程序简单等优点,可以作为新的成体干细胞来源。ADSCs是一种能够自我更新,并且具有多种分化潜能的新型干细胞,可用于急性或慢性组织损伤的修复与再生,诱导后移植到骨缺损部位可修复骨缺损。成骨细胞（Osteoblast, OB）主要由MSCs分化而来,其发育分化过程主要经历四个阶段,即细胞增殖、基质分泌、基质成熟和矿化形成等。该过程受一系列细胞因子、信号分子和周围环境因素等的影响和控制,包括骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）、转化生长因子2β（transforming growth factor-p,TGF2-p）、钙黏附蛋白（cadherins）等。其中BMP具有非常重要的作用,通过信号转导,具有诱导干细胞成骨的作用。BMP属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族的一员,在成骨细胞的发育过程中具有非常重要的作用,能够促进骨的形成。而骨形成的关键在于基质干细胞向成骨细胞分化,BMP在诱导MSCs成骨、修复骨损伤过程中具有非常重要的作用。BMP及其下游的级联蛋白组成的信号转导系统通过影响相关转录因子,如：核心结合因子α（Core-binding factorα1, Cbfα1）, Osterix （OSX）, Dlx5/Msx2等的表达,或是直接作用于成骨细胞特异性蛋白,如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）,骨钙素（osteocalcin, OCN）的mRNA,从而促进成骨细胞的分化,刺激骨形成。BMPs信号转导过程是：BMPs首先与Ⅱ型受体和Ⅰ型受体结合,Ⅰ型受体磷酸化Drosophila mothers against decapentaplegic protein （Smads）, Smads进入核内与转录因子相互作用影响相关蛋白的转录。Smads可分为受体调节Smads（R-Smads:Smad1、2、3、5、8和9）、共同介导者Smad （Co-Smad:Smad4）和抑制性Smads（I-Smads:Smad6、7）。其中Smad1、Smad5和Smad8,可能还有Smad9涉及BMPs的信号传导。与Smad1和Smad5相关的转录因子有核心结合蛋白A1 （core binding factor A1, CBFA1）、鸟氨酸脱羧酶拮抗酶（ornithine decarboxylase antizyme, OAZ）、Smad相互作用蛋白-1（smad- interacting protein 1, SIP1）、蟾蜍腹侧形成同源框蛋白-2（xenopus ventralizing homeobox protein-2, Xvent-2）、激活蛋白-1 （activating protein-1, AP-1）、生长抑素（sandostatin, Ski）、抗增殖蛋白（antip roliferative proteins, Tob）、同源结构域转录因子-8（homeodomain-containing transcription factor-8, Hoxc-8）等。其中CBFA1与TGF-β和BMP-2信号传导有关,能与Smad1、2、3、5相互作用,在骨形成中起重要作用。目的MSCs的多组织来源性,与筋膜结缔组织支架的全身分布性具有一致性,其横向、纵向分化的生物学特性,与筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式。本实验采用大鼠筋膜结缔组织皮下脂肪作为组织来源,分离培养ADSCs,并对其表型鉴定,探讨筋膜结缔组织中对机体产生支持储备作用的细胞学基础；研究ADSCs是否表达与骨损伤修复密切相关的BMP信号通路相关分子；骨损伤后,ADSCs在成骨修复损伤过程中其表面BMP受体和Smads的表达是否增加,BMP信号通路相关分子的表达是否增加。1、通过细胞分离培养判断非特异性筋膜结缔组织中是否存在未分化的间充质干细胞,以及这种干细胞的相关特性；2、通过RT-PCR技术观察ADSCs中BMP信号通路相关分子的表达,以证实ADSCs是否表达BMP信号通路相关分子；3.探索骨损伤后,在修复损伤的过程中自体ADSCs表面BMP受体和Smads的表达变化。方法1、取2月龄Wistar雌性大鼠腹股沟部皮下脂肪组织,采用酶消化法分离、培养脂肪源干细胞。通过细胞形态学、功能学、流式细胞术鉴定非特异性筋膜结缔组织中的脂肪源干细胞细胞是否符合间充质干细胞的特性以及部分表面标志,以验证非特异性筋膜结缔组织中是否含有间充质干细胞。2、将第4代ADSCs经成骨诱导和成脂肪诱导分化培养后,分别进行相应的碱性磷酸酶、茜素红和油红O染色,以鉴定ADSCs的分化潜能。同时取培养的第四代ADSCs进行流式细胞术检测部分表面抗原,证明ADSCs的干细胞特性。3、提取培养的第4代ADSCs的总RNA进行RT-PCR,检测BMP信号通路相关分子mRNA的表达。4、30只雌性Wistar大鼠随机分为空白对照组（A组5只）、实验组（B组25只）。A组不做处理,直接取腹股沟脂肪垫进行ADSCs培养。B组制造骨缺损模型。分别于造模后第1、3、7、14、21天,取腹股沟脂肪组织进行ADSCs培养,每次均取5只。原代培养第7天,提取ADSCs（?）总RNA,进行RT-qPCR检测骨形态发生蛋白受体（Bone morphogenetic protein receptor, BMPRs）和Smads的mRNA表达变化。结果1、光学显微镜下观察贴壁ADSCs形态多呈梭形、多边形,细胞大小均匀；2、流式细胞术鉴定ADSCs的表面抗原显示CD29、CD90、CD106呈阳性,CD11b、CD45、CD49d呈阴性；3、ADSCs在成脂诱导培养14天后,油红O染色显示特异性脂滴,而阴性对照孔中未观察到红染的脂滴。成骨诱导培养21天后,茜素红染色显示矿化结节呈特异性的粉红色,阴性对照孔中未见被染成粉红色的钙结节；4、RT-PCR检测结果显示ADSCs中BMP信号通路相关分子Bmprla、Bmpr1b、Bmpr2; Smad1、Smad5、Smad8的mRNA均阳性表达。5、RT-qPCR检测显示,大鼠在骨缺损刺激后,ADSCs中Bmprla、Bmpr1b、Bmpr2和Smad1、Smad5、Smad8的mRNA表达量增加。结论1、通过本实验,笔者认为在发育成熟Wister大鼠的筋膜结缔组织的脂肪中存在多能干细胞,而且可通过消化-贴壁-传代的程序分离得到这些ADSCs;为筋膜结缔组织对机体发挥着支持与储备作用（干细胞储备）提供实验支持,即筋膜结缔组织中的ADSCs为机体损伤修复提供细胞来源。2、ADSCs具有成体间充质干细胞特性,具有多向分化潜能,经定向诱导培养后可向成骨和成脂肪分化；ADSCs可能存在BMP信号通路。3、ADSCs表达BMP受体,表达BMP信号通路相关分子,骨损伤可引起大鼠ADSCs中BMP信号通路相关分子表达增加。综上所述,本研究分别采用了细胞分离培养、流式细胞术,成脂、成骨诱导培养及检测等技术手段,从ADSCs形态特征,成脂、成骨诱导、表面标志等方面探讨ADSCs。证实在发育成熟大鼠的结缔组织中存在间充质干细胞,提示分布于全身的筋膜结缔组织支架很可能就是机体内在的“干细胞库”。这种干细胞易于分离培养,具有良好的增殖、分化能力。笔者认为ADSCs是筋膜中间充质干细胞的一种主要细胞储备形式,更重要的是筋膜结缔组织对机体的支持与储备起着细胞储备作用,为机体损伤修复提供干细胞支持。通过RT-qPCR技术,从分子水平检测证实ADSCs表达与骨损伤修复密切相关的BMP信号通路相关分子,而且在骨损伤可引起大鼠ADSCs中BMP信号通路相关分子表达增加。提示骨损伤后,在骨损伤修复过程中,ADSCs可能参与修复损伤。机体可能通过产生某种活性物质作用,如细胞因子,炎症介质等,动员自身“干细胞库”在机体正常更新、损伤后的修复中发挥支持储备作用,为机体修复损伤提供干细胞来源。进一步验证了“筋膜学”理论所提及的损伤修复机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一章 脂肪源干细胞的培养及鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 大鼠脂肪源干细胞中BMP号通路相关分子的表达
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 大鼠骨缺损对脂肪源干细胞BMP信号通路相关分子表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 结论
• 4 讨论
• 参考文献
• 中英文对照缩略词表
• 成果
• 致谢
• 统计学合格证明